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1、高效液相色谱法测定粮食中玉米赤霉烯酮及其代谢物曾红燕 黎源倩3敬海泉(四川大学华西公共卫生学院,成都610041)摘 要 采用甲醇 2 水提取,C18小柱净化,反相HPLC荧光检测器测定了玉米、 面粉、 小麦样品中的玉米赤霉烯酮及其代谢物和黄曲霉B1。对样品预处理和高效液相色谱测定条件进行了优化, ZON,2ZOL,2ZOL和AFTB1的线性范围分别为5. 0g/L146 g/L, 25. 0g/L200 g/L, 25. 0g/L160 g/L和0. 4g/L2. 0 g/L,检出限分别为0. 5、2. 5、2. 5和0. 04g/kg;加标回收率在80. 0%110. 0%范围内;日间相对
2、标准偏差为415%9. 2% ,日内精密度2. 7%7. 4%。本方法灵敏准确,易于推广,适用于粮食中玉米赤霉烯酮及其代谢物的检测。关键词 玉米赤霉烯酮,黄曲霉毒素B1,高效液相色谱法,粮食2005203224收稿; 2005210202接受 本文系国家自然科学基金重点(No. 30030120)资助项目1 引 言玉米赤霉烯酮(zearalenone)是由粉红镰刀菌Fusarium roseum (F. graminearum)和其它镰刀菌产生的一种激素类真菌毒素。可引起各种谷物病变,主要发生在玉米、 高粱、 燕麦、 小麦、 大麦及谷子等农作物中。研究表明,玉米赤霉烯酮(ZON)及其代谢物(2
3、zearalenol,2zearalenol)具有类雌激素作用,能导致 动物雌激素水平过高及严重的生殖和不育问题1 。动物实验表明:玉米赤霉烯酮有致癌活性2 , ZON、2ZOL和2ZOL是否对人体也有潜在致癌性正在研究中。玉米赤霉烯酮污染饲料和食品后,不仅使农业经济受到严重影响,而且还会带来严重的食品安全问题,威胁到人类的健康。我国目前尚未制定食品中玉米赤霉烯酮的最大允许限量及标准检测方法。澳大利亚、 法国和俄罗斯等已经制定了食品和动物饲料中玉米赤霉烯酮的最大允许限量为301000g/kg3 。测定玉米赤霉烯酮的方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、 薄层色谱法( TLC)4 、 气相色谱法
4、(GC)5和毛细管电泳法(CEC)6 。美国AOAC的方法是薄层色谱法和高效液相色谱法。由于玉米赤霉烯酮在样品中的含量甚微,而共存干扰物质甚多,因此在玉米烯酮的测定中,提取和净化是十分重要的步骤。一般采用有机溶剂或有机溶剂 2 水体系提取,净化的方式主要有液 2 液萃取、 固相萃取小柱和免疫亲和柱净化等。目前,国内对玉米赤霉烯酮的检测方法鲜有报道,只有少数用高效液相色谱法7, 8 和免疫分析9的报道,而且都只检测玉米赤霉烯酮一种组分。本实验采用甲醇 2 水提取样品,经二氯甲烷萃取后, C18硅胶小柱固相萃取,直接荧光检测 2 高效液相色谱同时测定玉米赤霉烯酮等多种真菌毒素。较之AOAC的方法,
5、本方法简化了样品的前处理,可同时检测玉米赤霉烯酮及其代谢产物,具有简便快速,灵敏准确的优点,用于粮食样品的测定取得了满意的结果。2 实验部分2. 1 仪器与试剂HPLC带荧光检测器(HP1100,Agilent公司) ; C18硅胶小柱(J. T . Baker) ;超声波提取仪。标准品:Zearalenone (ZON)、 2Zearalenol (2ZOL)、 2Zearalenol (2ZOL)和Aflatoxin B1(AFT B1) (Sigma公司产品)用甲醇配制成标准储备液,浓度分别为1. 46 g、2. 00、1. 60和0. 02 g/L,于- 20 冰箱保存。甲醇和乙腈(色
6、谱纯, fisher公司)。本实验所用水均为重蒸水,所用试剂除指明外,均为分析纯(A. R. )。2. 2 实验方法2. 2. 1 色谱条件 色谱柱: Phenomenex ODS C18柱, 25 cm4 mm, 5m;流动相:水 2 甲醇 2 乙腈第34卷2006年3月分析化学(FENXIHUAXUE) 研究简报Chinese Journal ofAnalytical Chemistry第3期351354(461044,V /V) ;流速: 1. 0 mL /min;经荧光扫描测定各真菌毒素的激发光谱和荧光光谱,确定荧光检 测器工作波长,em =236 nm;em=418 nm;柱温: 2
7、5。2. 2. 2 标准曲线 在上述色谱条件下,测定不同浓度的混合标准溶液:2ZOL (0、8. 0、16. 0、32. 0mg/L) ,2ZOL (0、10. 0、20. 0、40. 0 mg/L) ,AFTB1(0、0. 10、0. 20、0. 40 mg/L) , ZON (0、7. 3、14. 6、29. 2mg/L) ,测定各待测物的色谱峰面积。2. 2. 3 样品处理 以市售玉米面、 面粉和针对性采摘的麦粒麦穗等为样品,经粉碎混匀后,称取10. 0 g 样品置于100 mL容量瓶中,加30 mL甲醇, 50 g/L NaCl溶液20 mL,振摇5 min后,超声提取30 min,用
8、 滤纸过滤到分液漏斗中,加入二氯甲烷萃取(分3次,每次20 mL) ,二氯甲烷层经无水硫酸钠脱水并收集于蒸发皿内,于恒温水浴(501)上挥干溶剂。用6 mL甲醇 2 水(4060)分3次溶解残渣,转入C18 小柱后,用4mL甲醇洗脱,收集洗脱液于具塞刻度离心管中,用氮气吹至1. 0 mL,以3000 r/min,离心5 min,取上清液进样测定。以保留时间定性,峰高增量法确认,标准曲线法定量。3 结果与讨论3. 1 提取条件的选择 分别用三氯甲烷、 二氯甲烷、 甲醇和乙腈等有机溶剂对粮食样品中待测物进行提取条件实验。结果 表明,以甲醇和乙腈的提取效率好,杂质峰较少,二者对待测物的提取效率差异不
9、大。因乙腈价格高,毒 性大,本实验采用甲醇做提取溶剂。由于样品提取时需要溶胀,为避免乳化,提取体系中加以5 g/L的NaCl溶液。当用50 mL甲醇 25 g/L NaCl(3020)提取时,粮食样品中待测组分的回收率最好(8210%103. 0% )。提取后,滤出提取液,残渣再经此提取液提取后测定,未检出待测组分,表明甲醇 25 g/L NaCl(3020,V /V)提取一次已将待测成分提取完全。所以用50 mL甲醇 25%NaCl(3020,V /V)为提取溶剂。 在甲醇 25 g/L NaCl提取后,需进一步从中提取待测物,比较了石油醚、 乙酸乙酯、 三氯甲烷和二氯 甲烷等有机溶剂。采用
10、石油醚提取,对各组分的提取效率为26%92%;乙酸乙酯萃取时分层困难;三 氯甲烷提取后杂峰较多,各组分的提取效率低;而二氯甲烷提取效率为82. 0%103. 0% ,而且杂峰少, 故本实验采用二氯甲烷(320 mL)为提取溶剂。3. 2 净化条件的选择 传统的液 2 液萃取要耗费大量有毒的有机溶剂,操作繁琐、 耗时,而固相萃取则具有消耗试剂少,操 作简单的优点。本实验采用了C18小柱净化。以甲醇、 乙腈等有机溶剂或它们的水溶液为洗脱剂,通过 比较,发现用甲醇洗脱效率最高。当甲醇的用量为4 mL时,洗脱效率达98%以上(见表1) ,故本实验 选择4 mL甲醇洗脱。表1 洗脱效率实验 Table
11、1 The efficiency tests of elution组分 Component加入量 Added(ng)脱用甲醇体积The volume ofmethanol (mL)1. 02. 03. 04. 05. 0洗脱效率 The efficiency of elution (% )2Zearalenol (2ZOL)16. 08. 27. 9NDNDND100. 62Zearalenol (2ZOL)5. 004. 120. 520. 33NDND99. 4 Aflatoxin B (AFTB1)0. 500. 360. 090. 030. 01ND98. 0Zearalenone (
12、ZON)14. 611. 82. 10. 50. 1ND99. 3ND:Not detected.3. 4 流动相、 流速和柱温的选择 按美国AOAC方法中流动相的组成H2OCH3OHCH3CN (432235,V /V)对标准混合溶液进行检 测,但2ZOL、AFTB1和ZON 3个色谱峰未能完全分离。进一步改变条件,当水的比例小于40%时,保 留时间太短,各色谱峰分离差;在60%以上时,峰展宽严重而且峰形拖尾;当水的比例为46%时,各峰分离较好;甲醇比例为10%时,色谱峰峰形对称。在此基础上对流动相的组成(H2O、CH3OH、CH3CN)进行了三因素四水平L16(4)3正交试验,选择本实验的
13、最佳流动相组成,因素水平见表2。253 分 析 化 学第34卷图1 混合标准溶液(a)和样品(b)的色谱图Fig . 1 The chromatograms of mixed standards ( a) andsample (b)1.2 玉 米 赤 霉 烯 醇(2zearalenol) ;2.2 玉 米 赤 霉 烯 醇(2zearalenol) ; 3.黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1) ; 4.玉米赤霉烯酮(zearalenone)。结果表明,当流动相的组成为H2OCH3OHCH3CN =461044 ,流速为1. 0 mL /min,色谱柱温 度为25 时,待测组分与杂质峰均能达
14、到完全分离,峰形对称,分析时间不超过15min。标准溶液和 样品的色谱图见图1。表2 因素水平表 Table 2 Orthogonal design test水平 Level流动相组成 Composition of mobile phase, H2OCH3OHCH3CN流速 Rate of flow (mL /min)柱温 Column temperature ()14611430. 82524610441. 0303469451. 2353. 4 方法性能指标考察3. 4. 1 线性范围及检出限 在本实验优化的条件下ZON、 2ZOL、 2ZOL和AFT B1的标准曲线线性范 围分别为: 5
15、. 0g/L146 g/L, 25g/L200 g/L, 25g/L160 g/L和0. 4g/L2. 0 g/L,线性相关 系数为0. 9950. 999。以试剂空白的基线噪声3倍所对应的浓度作为方法的检出限,以上4种真菌毒素的检出限分别为: 0. 5、2. 5、2. 5和0. 04g/kg。3. 4. 2 精密度 在选定的色谱条件下,在同1 d内连续7次测定混合标准溶液,每次均为10L,测定各组分的峰面积,计算日内精密度,RSD为2. 7%7. 4%。连续7 d分别测定混合标准溶液,每次均为10L,测定各组分的峰面 积,计算日间精密度, RSD为4. 5%9. 2%。3. 4. 3 回收率
16、 在选定的色谱条件下对市售 玉米面、 面粉和针对性采摘的麦粒、 麦穗等粮食 样品进行了测定,其中玉米面、 面粉为阴性样 品,麦粒和麦穗为阳性样品。用阳性样品进行了加标回收实验,各组分的回收率在80. 0%110. 0%之间,结果详见表3。 综上所述,本研究建立了液 2 液超声波提 取, C18小柱净化, HPLC荧光检测同时测定粮食 样品中玉米赤霉烯酮及其代谢物和黄曲霉毒素表3 样品回收率实验(n=3)Table 3 The recovery tests of samples(n=3)样品 Sample组分 Component本底值 Content ( mg/L)加入量 Added ( mg/L)检测值 Found ( mg/L)回收率 Recovery (% )麦穗 Ear2ZOLND1. 60 3.
