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1、第三章 分子克隆载体（Molecular cloning vectors） 周毅峰 2013春在基因工程中，通常是把外源DNA片断利用运载工具送入生物细胞。携带外源基因进入受体细胞的这种工具叫做载体(Vector)。载体(Vector)载体的本质是DNA。经过人工构建的载体，不但能与外源基因相连接，导入受体细胞，还能利用本身的调控系统，使外源基因在新细胞中复制以致功能的表达。 Gene EngineeringGene EngineeringGene EngineeringGene Engineering基因工程中常用的主要载体质粒(Plasmid)，主要指人工构建的质粒噬菌体载体 柯斯质粒 (
2、cosmid)单链DNA噬菌体M13动物病毒人工染色体 (artificial chromosome)Gene EngineeringGene Engineering载体的功能及特征载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件Gene EngineeringGene Engineering载体应具备的条件具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性） 具有合适的筛选标记 具有较高的外源DNA的载装能力 具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点 Gene EngineeringGene Engi
3、neeringpBR3224363 bpGene EngineeringGene Engineering克隆载体（cloning vector）对目的基因克隆，建立DNA文库和cDNA文库，其上有复制子即可按功能分类表达载体（expression vector）使目的基因在宿主细胞中表达，既有复制子，又有强启动子穿梭载体 （shuttle vector）可以在原核细胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达。Gene EngineeringGene Engineering第一节 质粒 （Plasmid）质粒是一种独立于染色体外的小分子环状DNA，一般大小约106108D，可自身复制和表达。Gene
4、EngineeringGene EngineeringGene EngineeringGene Engineering基因克隆载体的质粒DNA分子，必定包括：复制基因、选择性记、克隆位点。 Gene EngineeringGene Engineering1 质粒的基本特性 2 质粒DNA的分离纯化4 重要的大肠杆菌质粒载体 3 质粒载体的构建及类型 Gene EngineeringGene Engineering1.1 质粒DNA的构型 两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构，称为共价闭合环形DNA（cccDNA），通常呈现超螺旋的SC构型 只有一条DNA链出现有一至数个缺口，称为开环DNA（o
5、cDNA），此即OC构型 线性分子DNA（IDNA），称为L构型 1 质 粒 的 基 本 特 性 Gene EngineeringGene EngineeringGene EngineeringGene Engineering1.2 质粒DNA分子大小质粒宿主分子大小/kb pPbs蓝藻1.5 ColE1大肠杆菌6.4 ColV2大肠杆菌140 Ti致癌农杆菌330左右 PV21三叶草根瘤菌700 F大肠杆菌94Gene EngineeringGene Engineering1.3 质粒的自主复制性质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系
6、根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）的多少，质粒可分为两大复制类型：严紧型质粒（stringent plasmid）在宿主细胞中拷贝数少的质粒，1数个拷贝松弛型质粒（relaxed plasmid）在宿主细胞中拷贝数多的质粒，10个拷贝以上Gene EngineeringGene Engineering低或单拷贝质粒的复制必需由复制子本身编码一个 必不可少的顺式作用蛋白(repA)来对复制起点作正调控作用，如psc101等，同时其复制受宿主蛋白合成的影响。所以这些质粒的拷贝数不能通过诸如氯霉素等蛋白质合成抑制剂来增加拷贝数1） 松弛复制型多拷贝质粒（pMB1或ColE1等）的复制不受宿主菌蛋白合
7、成的影响的影响；当蛋白质合成不能进行时，复制依然进行2) 严紧型复制Gene EngineeringGene EngineeringHow many copies can be replicated ?Gene EngineeringGene EngineeringNegative controlpositive control answers Repressor model: cop factorAntisense RNA model: RNARNARep proteinpMBl/colEl复制子pSC101复制子Gene EngineeringGene EngineeringRNARNA和
8、和RNARNA复制复制copiescopies的调节的调节RNARNA由由oriori上游的上游的550550到下游的到下游的200200转录出约为转录出约为750nt750nt的的RNARNARNARNA由由RNARNA基因反义链编码的基因反义链编码的108nt108nt的的RNARNA，与，与RNARNA互补互补 控制复制引物与模板的结合Gene EngineeringGene EngineeringRNARNA在在RNaseHRNaseH的作用下加工成的作用下加工成550nt550nt的成熟引物，起始复制的成熟引物，起始复制RNARNA55端产生一个富含端产生一个富含GG的环与的环与or
9、iori上游上游20bp20bp处的富含处的富含C C区互补区互补0-555 0 RNA-2 RnaseHOHRNA-2DNA / RNA primer for DNA replication +150Gene EngineeringGene Engineering此处复杂的RNA二级结构的正确折叠是复制起始的关键Gene EngineeringGene EngineeringRNA-108 bp RNase H 不能识别RNA-2, 不能形成primer 的3-OH -555 -4450RNA-RNA- RNA- 108 bp D.S. RNARNARNA与与RNARNA互补后，不能起动复制
10、互补后，不能起动复制质粒复制依赖于宿主酶质粒复制依赖于宿主酶活性，一旦开始复制则活性，一旦开始复制则不能自主控制自制速度不能自主控制自制速度和进程，故必须在复制和进程，故必须在复制启动前或启动时由启动前或启动时由RNARNA来控制来控制Gene EngineeringGene EngineeringRNA-1 0 When RNA-2 200-360Nt Rom gene expression, RNA- / RNA-D.S. repression RNA- / RNA- 不能形成primer的 3-OH 促进 限 制 63 aa ROP (Rom protein) RNA- 只能转录到100
11、-220 base, 不能到达“0”原点 不能形成primer 的3-OH0Gene EngineeringGene EngineeringRNA和RNA之间“亲吻复合物”的放大。由RNAI和RNA形成稳定的复合物通过抑制RNA与DNA稳定杂交体的形成而阻止DNA合成。 与Rom/Rop二聚体蛋白结合，使RNA I与RNAll形成稳定的“亲吻”复合物。Rom RNAmodulator(调节器)Roprepressor of primerGene EngineeringGene EngineeringPcopcopP/OrepreporiCopRep 控制复制起始因子与复制起始位点（ori）的结
12、合Gene EngineeringGene Engineering质粒载体及其拷贝数质质粒 复制子 拷贝贝数 pBR322 及其衍生质粒 pMB1 1520 pUC 系列质粒及其衍生质粒 突变的 pMB1 500700 pACYC 及其衍生质粒 p15A10212pSC101 及其衍生质粒pSC101 5 ColE1ColE11520Gene EngineeringGene EngineeringGene EngineeringGene Engineering两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性，它是指在第二个质粒导入后，在不涉及 DNA 限制系统时出现的现象。不相容的质粒一般都
13、利用同一复制系统，从而导致不能共存于同一宿主中。1.4 质粒的不相容性Gene EngineeringGene Engineering不相容性的质粒组成不相容性的质粒组成不相容性群不相容性群以大肠杆菌的质粒为例：ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容Gene EngineeringGene Engineering质粒的不相容性：分子机制两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，两种含有不同复制子结构的不同质粒
14、，在复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势Gene EngineeringGene Engineering1.5 质粒DNA的转移 G细菌质粒接合型的质粒（conjugative plasmid）非接合型的质粒（non-conjugative plasmid）接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等如Col、R的其它成员非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用Gene EngineeringGene
15、 EngineeringF质粒大肠杆菌的某些品系的雄性或供体是被一个致育因子（fertility factor）或性因子（sex factor）决定的F因子，具有这种因子的能育品系记为F，相当于雄性。不含这种致育因子F的品系记为F，相当于雌性。 F+细胞的F因子通过接合管向F细胞转递使F变成F，F因子还可改变细胞表面的构造，以防F细胞间的接合。Gene EngineeringGene EngineeringR质粒也称抗药性因子。R质粒编码一种或数种抗菌素抗性基因，此种抗性通常能转移到缺乏该质粒的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力 Gene EngineeringGene Enginee
16、ringCol质粒：此类质粒编码有控制大肠杆菌素合成的基因，即所谓产生大肠杆菌素因子。大肠杆菌素是一种毒性蛋白，它可以使不带Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死。 Gene EngineeringGene Engineering1.6 携带特殊的遗传标记野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义Gene EngineeringGene Engineering按其用途可将标记基因分为选择标记基因筛选标记基因用于鉴别目标 DNA （载体）的存在，将成功转化了载体的
