《渤海海泥放线菌非培养多样性研究答辩论文》由会员分享，可在线阅读，更多相关《渤海海泥放线菌非培养多样性研究答辩论文（25页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、渤海海洋沉积物放线菌非培养 多样性研究指导老师：李静老师 学生姓名：曹燕兵 专业年级：生物科学2008级内容提要1、前言放线菌（ Actinomycetes)一类具有分枝状菌丝体的， 高GC含量的革兰氏阳性细菌 。代谢活动活跃，次级代谢产 物丰富多样。海洋放线菌（marine Actinomycetes ）海洋放线菌的分布十分广泛海洋特殊环境的选择压力造就了海洋放线菌物种 及代谢产物的独特性、多样性，所蕴涵的应用潜 力不可估量。渤海简介 近封闭的内海，地处中 国大陆东部的最北端，盐 度仅为30PSU 近10年来,陆域活动造成 的渤海中部海区水质下降 和富营养化等环境污染问 题正不断引起各方面的
2、高 度重视,海区及其周边区 域的生态环境正面临着越 来越大的压力渤海北部海域海洋放线菌的研究 在我国，对海洋放线菌的研究已有初步规 模。但基本上集中在南方红树林生境、南海 以及南北极和部分热泉等特定环境中，而对 北部海洋放线菌的研究非常少。 已见报道的为青岛近海和大连、烟台沿岸 潮间带中可培养放线菌。 对渤海这一受人为活动影响较大、环境恶 劣的区域，海洋放线菌的群落结构、资源、 多样性会有什么样的变化，还很少有研究。2、材料与方法材料渤海样品B71-2 采集时间:2011.6.2819:39地 理位置: 12019.620E 380.555N 水深19.9米 沉积物渤海样品B37-3 采集时间
3、:2011.6.24 14:03 地理位置: 12113.044E 3806.429N 水深32米 下层40cm沉积物方法放线菌宏基因组DNA的提 取及纯化周法试剂 盒法放线菌特异性引物扩增A-19、S-20连接转化、构建克隆文库RFLP系统进化树构建多样性分析分析测序结果Mothur r.1.25.0EstimateSwin820Mega 5.03、实验结果与分析3.1、总总DNA的提取及放线线菌特 异性序列的扩扩增 样品B71-2,B37-3的总DNA琼脂糖凝 胶电泳检测结 果见图1。 B71-2电泳条带比B37-3的条带稍亮 ，可以看出两个样品中DNA含量都 很高图1：宏基因组DNA电泳
4、检测结 果M: -Hind III Marker；1：B71-2 2：B37-33.2、两个样品的 总DNA用放线菌特异性引 物（S-20，A-19）进行 扩增，在640 bp处出现 目的条带（见图2）。图2：放线菌特异性引物扩增DNA电泳检测结 果 M：Marker D2000 1：对照 2：B37-3 3：B71-2M 13.3菌落PCR电泳验证结果 利用放线菌特殊引物s-20；a- 19为引物进行连接转化，对 菌液进行PCR的结果（部分样 品）如图3：图3、菌落PCR电泳图像 1：Marker D2000 条带：B71-2 69-783.4 Hae III酶 切后电泳结 果 部分样品如
5、图3-3：图3-3：Hae III酶切电泳结果 1：Marker D2000 条带：B71-2 39-583.5、分析测测序结结果（B71-2）克隆序列经Mothur r.1.25.0进行OTUs划分，并 用核糖体数据库对其分类位置进行划分。经分析：B71-2样品的27个克隆子获得了23个 OTUs,其中 34.8%的克隆序列分布于放线菌门(phylum Actinobacteria)放线菌亚纲(Actinobacteridae)和酸 微菌亚纲(Acidimicrobidae)中，并且在这两个亚纲中 有62.5%的克隆序列属于放线菌的新分类单元3.6 多样性指数分析（B71-2)运用Estim
6、ateSWin820软件，分析B71-2位点的放线菌 16srDNA基因文库，文库中96个克隆的稀有度曲线如 下图。渤海沉积物B71-2位点放线菌稀有度曲线 香农指数是反映物种丰富度和物种均 匀度的综合性多样性指数；辛普森指数 （Simpsons diversity index ）是 一种简便的测定群落中物种多样性的指 数。计算得B71-2位点的shanno指数为 3.09，simpson指数为0.0783。 覆盖度（Coverage C）为78.26%3.7 系统进化树分析（B71-2）由进化树可看出参与构建树的25个克隆子中有17个克隆 子（占68%）与有效发表 的 所 有 类 群 无 较
7、 近 的 亲 缘 关 系 ， 如 克 隆 序 列62、69、87，它们以极 高的自展值支持形成一个独立的大分支，极有可能代表一 个新亚目或更高级分类单元的类群。3.5、分析测序结果（B37-3） 经分析：B37-3样品的31个克隆子获得 了24个OTUs，其中 37.5%的克隆序列分布 于放线菌门(phylum Actinobacteria)放线 菌亚纲(Actinobacteridae)和酸微菌亚纲 (Acidimicrobidae)中，并且在这两个亚纲 中有66.7%的克隆序列属于放线菌的新分类 单元;3.6 多样性指数分析（B37-3)运用EstimateSWin820软件，分析B37-
8、3位点的放线菌 16srDNA基因文库，文库中96个克隆的稀有度曲线如 下图。渤海沉积物B37-3位点放线菌稀有度曲线shanno指数 为3.06。 simpson指数 为0.0791. 覆盖度（ Coverage C ）为79.16%3.7、系统进化树分析（B37-3)由进化树可看出参与构建树的25个克隆子中有17个克隆子（占 71%）与有效发表 的 所 有 类 群 无 较 近 的 亲 缘 关 系 ， 如 克 隆 序 列24、74、91，它们以极高的自展值支持形成一个独 立的大分支，极有可能代表一个新亚目或更高级分类单元的类 群。4、讨论1、实验结果表明，渤海沉积物放线菌多样性程度 非常高。但本次试验只挑选了96个克隆子，导致覆 盖度比较低。想要更深入的了解渤海地区海底沉积 物中放线菌多样性，需要适当增加挑取的克隆数， 选取更多的克隆子进行测序分析。2、通过对渤海两个位点B71-2、B37-3的研究分析 ，发现渤海沉积物中蕴含大量未培养的放线菌资源 ，发现渤海沉积物中含有大量未培养的放线菌新的 分类单元。3、鉴于常规培养方法得到的大多是链霉菌属，因 此非常有必要设计、优化新的培养基和方法，将这 些未培养放线菌资源转变为可培养资源，为我国海 洋放线菌的开发利用提供一定的资源储备。致谢感谢李静老师的精心指导和严格要求 感谢各位老师的评阅和指正
