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1、全球基金疟疾项目 镜检技术培训（二）户县疾病预防控制中心 2012年3月28日疟原虫检验技术v 采集血样v 血片制作v 血片染色v 疟原虫镜检采集血样采血部位：耳垂或无名指，取血方法：通常在耳垂取血，先 用75%酒精棉球消毒取血部位， 待酒精干后，用左手拇指和食 指紧捏耳垂上方或无名指指尖 ，右手持消毒针迅速刺入皮肤 ，不宜过深或过浅。然后用右 手中指轻轻挤压出血。厚血膜 血量约一粒米大小,薄血膜血量 为厚血膜的一半或1/3。厚血膜：用推片的一角，取血 一小滴（约44.5微升）， 置于平置的载玻片上，由 里向外一个方向旋转，涂 成直径0.81厘米大小圆形 厚血膜。 薄血膜：以推片一端的中部取
2、血一小滴，使血滴与载玻 片接触，血液沿推片边缘 向两侧展开，将推片与载 玻片保持300-450，均匀而迅 速适当地用力向前推成舌 形薄血膜。血片制作（一 ）厚血膜薄血膜血片制作（二 ）标准的疟疾厚薄血膜片：v把载玻片分成六等份，把厚血膜涂在从右到左的第三格中 央，薄血膜涂在第四格前缘至第六格中部，第一、二格备 贴标签编号用。厚、薄血膜间用蜡笔划线分开v厚血膜血量不宜过多或过少v薄血膜平整,无皱折和空泡.显微镜下红细胞单层排列血片制作（三 ） 不同血片涂布法：v标准血片v门诊发热病人血片v居民普查血片血片染色（一）染色方法:v吉氏染色法v瑞氏染色法WHO推荐使用吉氏染色法血片染色（二 ）吉氏原液
3、的配制： 吉氏染粉 (Azure B type) g甘油 (纯) 50ml甲醇 (纯) 50mlv把吉氏粉置于研钵中，加少量甘油充分研磨, 然后边加 边磨，直至50ml甘油完全加入，倒入棕色瓶中。然后在 研钵中加入少许甲醇清洗研钵，洗液倒入棕色瓶中，再 放入甲醇清洗，反复数次，直至甲醇用完。盖好瓶盖， 充分摇匀，置于65温箱中24小时，或室温阴暗处1-2 周后过滤，备用。v整个染色液配制时间不能少于5个小时v时间越长染色效果越好。血片染色（三 ）吉氏染液的配制：v把吉氏原液用PH7.00.2缓冲液稀释，比 例约为1:1520，稀释后方可用于厚薄血 片染色。v吸取原液时，不要晃动瓶子,以免沉淀物
4、泛 起影响染色效果.血片染色（四 ）v血膜固定：血膜充分晾干后，用甲醇固定薄血膜。厚 血膜上滴加蒸馏水进行溶血，到血膜呈灰白色时，将 水倒去，晾干后再用甲醇固定。 注意：薄血膜固定时，甲醇不可触碰未溶血的厚血膜 。厚血膜溶血时，蒸馏水不可触碰薄血膜。血片染色（五 ）v血片染色： 1.吉氏染色法：把吉氏染液滴加于已固定的厚、薄血膜上，室 温染色30分钟，用缓冲液冲洗干净。血片晾干后镜检。 2.快速吉氏染色法：取吉氏原液1ml，加缓冲液5ml，混匀后， 滴加于厚、薄血膜上染色5分钟，用缓冲液冲洗，晾干后镜 检。血片染色（六）3.成批血片染色：将已固定的血片插入染色缸，加入吉氏染液 浸没血片，对厚、
5、薄血膜同时染色30分钟。 注意：如果吉氏染液是从市场上购置的成品试剂，请严格按照 说明书操作。血片染色（七 ）血片染色结果：v染色质量好的血片 ：显微镜下核呈红 色，胞浆呈蓝色， 薄血膜平整，红细 胞单层排列。v如果血片偏红,说明 染液偏酸性v如果血片偏蓝,说明 染液偏碱性吉氏染色血片外观血片染色（八）v血片制作与染色注意事项： 、载玻片必须清洁无油污； 、固定薄血膜时，甲醇不要触碰到厚血膜； 、厚血膜在染色之前先用清水滴加在上面进行溶血 ，以防厚血膜染色后颜色发黑，影响镜检； 、血片充分干燥后方可染色，防止冲洗染液时厚血 膜脱落。 5、未染色血膜的放置时间夏天不宜超过48小时，冬 天不宜超过
6、72小时，否则厚血膜会自然固定，影响 镜检。疟原虫镜检（一）厚血膜 薄血膜优优点血量多，面积积小，原 虫较为较为 集中。原虫 检检出率高血量少，面积积大，干燥快红红 细细胞完整，原虫形态态极少变变 形。用于观观察原虫形态态与鉴鉴 别别虫种。缺点原虫在干燥过过程中皱皱 缩缩，红细红细 胞消失，原 虫变变形较较大，原虫 鉴鉴定困难难血量比厚血膜少许许多，但面 积积是厚血膜的8-10倍。检查检查 费时费时 ，原虫检检出率较较低用途用于疟疟疾病人检查检查虫种、虫期鉴鉴定及初学者教 学标标本疟原虫厚、薄血膜镜检优缺点显微镜下厚血膜读片顺序疟原虫镜检（二 ）v读片顺序：显 微镜镜下按由 上而下、之字 形顺
7、序读片疟原虫镜检（三）镜检疟原虫结果判断：v阴性血片：检查全部厚血膜视野未查见疟原虫；最少检查100个厚血膜视野未查见疟原虫（临床病人 ）。v阳性血片：检出各期疟原虫（环状体、裂殖体、配子体 ）。v混合感染：在一个血膜上有2种以上疟原虫感染称为混 合感染，较常见的是间日疟原虫与恶性疟原虫混合。v镜检判断P.v+P.f混合感染：必须是看到P.v各期原虫和 P.f的配子体。间日疟和恶性疟的鉴定要点疟原虫镜检（四）疟原虫镜检（五）v疟原虫形态特征：间日疟（P. vivax ） 鉴定要点1.红细胞通常涨大 2.薛氏点明显 3.成熟环状体粗大4.滋养体胞浆有阿 米巴样伪足5.血片中可见各期 的原虫形态6
8、.成熟裂殖体约含 12-24个裂殖子疟原虫镜检（六）v疟原虫形态特征：恶性疟（P.falciparum）鉴定要 点：1.红细胞不涨大 2.小滋养体（环状体） 纤细, 常有多重感染 ，环状体内可有2个 核 3.环状体可贴在红细胞 边缘 4.血片中没有其他发育 期的大滋养体 5.配子体呈新月形或腊 肠形 6.成熟裂殖体约含16- 32个裂殖子 7.可出现茂氏点镜检示教v以下血片采自现症病例疟原虫镜检（七）间日疟环状体2. Intermittent fever; arrived from India 2 months ago. 间日疟滋养体3. History of round the world
9、safari including S. America, Asia and Africa. General malaise. 恶性疟雄配子体4. Unspecified overseas travel. Presented with temperature 38.4C 三日疟裂殖体5. Male recently returned to Australia after backpacking through Asia. History of flu like symptoms. 白细胞6. “New Australian“ previously from Malaysia. Intermitt
10、ent temperatures and headaches. 白细胞7. Aches and pains, with fever. ? Glandular Fever, ?malaria. 间日疟裂殖体恶性疟环状体18. Recent trip to Southern India- headaches and vaguely unwell. 间日疟裂殖体19. Patient has been holidaying in the Dominican Republic, now feverish. 恶性疟雄配子体21. A member of the UN forces in East Tim
11、or. Presented with high temperature. 恶性疟雌雄配子体间日疟裂殖体恶性疟雌配子体间日疟裂殖体血检质量考核v 实验室条件v 血检工作要求v 考核标准实验室条件v人员：各单位至少有1名专职或兼职的经过疟原虫检 验技术培训的人员。熟悉疟疾血片的制作，疟原 虫的镜下特征，能承担疟疾血检工作。v环境：实验室相对独立，可做疟疾血检。v设备：显微镜、玻片、玻片架、玻片合、染色缸。v试剂：吉氏染液、甲醇、二甲苯、镜油。血检工作要求 v制定疟原虫镜检实验室管理制度、疟原虫镜 检操作规程v对血检对象进行认真登记，填写疟原虫镜检登记 表，按接样顺序编号。编号：医院名称代码序 号。
12、v保留镜检过的所有血片，以备上级抽样复查，经上 一级机构同意后方可清洗。阳性血片须专人管理。v血液标本有潜在生物危害，在实验室血检工作、标 本保存中应严格遵守实验室生物安全通用要求 。县（市/区）全球基金疟疾项目发热病人疟原虫血检登记表 血检单位： 、 序 号姓名年 龄龄性 别别居住地址外出 史及 地点职职 业业发发 病 日 期体 温 （ oC)临临 床 初 诊诊血 检检 日 期血检检方法血检结检结 果检检 验验 人 签签 名血 样样 编编 号 镜镜 检检RD T阴 性PfPvPmPo混 合1234合 计计疟疟原虫血检检考核标标准(1)项项目检查检查 内容质质量标标准考核 分值值好分 值值中分
13、 值值差分 值值血 片 制 作厚血膜 (25分）血量（5分）45l5略多或略少3过多或过少1位置（5分）玻片右1/3 5稍偏右4偏右过多 3直径（5分）0.81.0cm50.70.8 或1.0 1.2cm31.2cm1外观(10分)圆形厚膜均匀, 边缘 整齐10圆形稍不均不整齐8厚薄不匀影响着色5薄血膜 (25分）血量（5分）11.5l5略多或略少3过多或过少1位置（5分） 直径（5分） 外观(10分）玻片1/21/3处5稍偏右或偏左4偏右或偏左过多32.52.0cm5稍大或稍小 3过多或过少1舌状厚薄均匀10舌状稍不均 5厚薄不匀呈波浪型3考核标准疟原虫血检考核标准（2）项项目检查检查 内容
14、质量标准考核 分值值好分 值值中分 值值差分 值值血片染 色质质量 (15分)外观 （5分 ）蓝紫色5深蓝色3红色或灰白色2镜下 (10分)白细胞、疟原 虫胞浆蓝 色， 核红色10染色过深，原 虫胞浆与核均 呈深蓝色8染色过浅，胞 浆蓝 色不易显 见，核淡红5血片清 洁洁度 (10分)外观 （5分 ）光洁无油灰5稍有油污2油灰粘连2镜下 （5分 ）无沉渣5稍有沉渣2沉渣多或有杂 菌2疟原虫血检考核标准（3）项项目检查检查 内容使用标标准扣分标标准考核 分值值显显微镜镜使 用 （25分）使用前 （10分 ）显微镜干净，有绸布遮盖，接 物镜不与聚光器对接显微镜稍有灰（-2分），无 绸布遮盖（-4分），接物镜 与聚光器对接（-4分）镜检时 （10分 ）打开光源，调节 亮度，聚光器 上升至最高位置，油镜与聚光 器对接，放入待检血片，镜台 上升直至油镜与血膜接触，然 后镜台徐徐下降，出现视 野用 微调调节 聚光器未上升至最高位置即 放血片（-2分），镜台上升 或下降过快（-3分），压破 玻片（-10分）使用后 （5分）擦拭干净油镜，物镜转 离聚光 器，绸布遮盖未擦拭油镜（-1分），物镜 未转离聚光器（-2分），未 用绸布遮盖（-2分）合计计100分
