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1、云南省大学生创新创业训练计划云南省大学生创新创业训练计划 项目立项申请表项目立项申请表推 荐 学 校： 玉溪师范学院项 目 名 称： 红瘰疣螈形态结构与生存的实验研究项目 申报 类别： 创新训练所属一级学科名称： 生物学申 请 人： 段登武所在学院及年级： 资源环境学院 09 级生物科学指 导 教 师： 李红梅 单 位 和 职 称： 玉溪师范学院资源环境学院 副教授填 表 日 期： 2012 年 4 月 18 日云南省教育厅高等教育处 制2012 年 2 月一、项目申请人情况一、项目申请人情况 姓 名段登武性别男民族汉出生日期 1989.10.15所在学院 资源环境学院专业、班级 生物科学 2
2、009 级 项目名称 红瘰疣螈形态结构与生存的实验研究申请人通讯地址云南省玉溪师范学院电话 15187701855 项目类别 创新训练 创业训练 创业实践 项目周期2012 年 3 月-2013 年 3 月所属学科专业生物科学申请人参加科研的经历自何年月至何年月参加的项目担任的工作20102011玉溪市白鹭栖息地及种群结构调查参与项目组其他成员（不超过 5 人，不包括申请人和指导教师） 姓 名性别年级所在学院专 业分 工签 名王啟能男2009 级玉溪师范学院生物科学标本采集、解剖观察王啟能彭东燕女2011 级玉溪师范学院生物科学资料查询、 骨骼标本 制作彭东燕肖小柳女2011 级玉溪师范学院生
3、物科学组织切片 制作、记 录肖小柳二、拟申报项目情况二、拟申报项目情况（一）项目介绍 （研究目标、研究背景及现状、工作原理和方案设想、计划进度安排等研究目标、研究背景及现状、工作原理和方案设想、计划进度安排等） 目标目标: : 1、通过对红瘰疣螈的外形及内部结构和组织研究观察，了解其结构特征，认识其适应 环境生活的特有组织特性，为人们对其的保护提供科学理论依据； 2、通过对其外形及内部结构的观察研究，可为红瘰疣螈的室内人工养殖提供一定的科 学依据，进而达到红瘰疣螈的保护目的。背景及现状：背景及现状：1.概述生物学特征红瘰疣螈属于两栖纲（Amphibia）有尾目（Caudata）蝾螈科（Sala
4、mandridae）疣螈属（Tylototriton）的代表动物之一，雄螈全长 136mm150mm，雌螈 147mm170mm。头部平扁，两侧脊棱显著隆起，无唇褶，体两侧各有 1 排球形瘰粒 1416 粒。彼此分界明显。指4，趾 5。尾较弱而侧扁，鳍褶较低。背面棕黑色；头部、四肢、尾部以及背脊棱和瘰疣部位均为棕红色或棕黄色。捕食蚯蚓、蜈蚣、步行虫、蜗牛等为食。数量也较多，但其去内脏的干制品称“蛤蚧”被捕捉；又以其色斑艳丽，活体也被出售供饲养观赏，数量急剧减少。随着人口增长及科技的进步，人们对环境的污染也越来越严重，大事开发山区，其栖息环境日益缩小，也影响其数量，亟需加以保护。红瘰疣螈一般生活
5、于海拔 9002 000m 高的山区潮湿地区或水塘中，雨季常在田边地角，乃至菜地沟槽、菜地埂子草丛均可见到。有时 23只，也有 45 只成小群活动寻食。每年 57 月为繁殖期，这时漫湾地区正处在雨季，山涧的积水塘、稻田水中是它们交配产卵、孵化场所。9 月 25 日10 月 1 日已见到较多的幼螈，体全长约 7885mm，已接近成体，体背瘰疣已明显形成，色彩也近于成体，但不如成体鲜艳。地位（1）中国物种红色名录评估等级： 近危 NT 几近符合易危 VU ；依据标准：由于该种在中国出现范围仅 20,000 km2，分布区分裂，栖息地的面积和质量持续下降，过度捕获使得该物种接近 “濒危”等级，因此被
6、列为 “近危”等级； （2）红瘰疣螈是我国级保护动物， 在中国红皮书等级 上：属于需予关注 （中国红皮书等级生效年代：1996）。2.地理分布我国分布：红瘰疣螈是我国的特有种, 或主产于我国；在我国主要布于云贵高原和四川、重庆、甘肃、湖南、安徽、广西、海南。云南分布：在云南主要分布于中部、西部和南部。新平水塘，嘎洒，耀南也是其主要栖息地。最主要产于云南西南部丽江、泸水、盈江、保山、腾冲、龙陵、陇川、永德、云县、凤庆、南涧、双柏、新平、建水、绿春、景东共 16 县。显然，它在云南的分布也仅是少数县，占云南 129 县、市的 12.4。3.研究现状主要涉及到的研究方向：红瘰疣螈皮肤的显微结构的观察
7、；红瘰疣螈的繁殖生态；红瘰疣螈胚胎发育的初步观察；从线粒体 Cyt b 基因探讨红瘰疣螈物种地位的有效性红瘰疣螈的体温调节等；因此，本次研究是一个相对新颖的研究项目，对于红瘰疣螈这方面的研究尚未涉及，故很具有研究价值。工作原理和方案设想：工作原理和方案设想： 工作原理：工作原理：以形态结构解剖观察为出发点，对红瘰疣螈进行进一步的了解，观察其内部形态结构特征，了解其对环境的需要，制作各结构组织切片，对各结构进行组织切片观察，进而全方位的对红瘰疣螈进行观察了解，最终达到目标要求为红瘰疣螈的保护措施的制订提供科学的理论依据。通过现象了解本质，通过观察红瘰疣螈的形态结构及各结构的组织特点，了解红瘰疣螈
8、的特有特征与对环境的适应特性，从而在在红瘰疣螈采取保护措施时有一定的科学理论依据。石蜡切片法是玻片标本制作的一种常用方法 ,此法的主要优点是切片薄而均匀 ,并且切片可以连续不断 ,有些不能用徒手切片的柔软材料 ,用石蜡包埋切片 ,效果很好。操作步骤具较强的可操作性。透明骨骼标本是利用化学药品和染料，对动物体的肌肉和骨骼进行固定、染色，再把肌肉上的颜色退去，以保留骨骼上的颜色，借助药品的作用，促使肌肉透明，使被埋藏在肌肉中染有颜色的骨骼显现出来。适用于小型脊推动物和幼体。透明骨骼标本的制作过程，主要有：剥皮去内脏、材料的固定、透明、染色、脱色、脱水、保存等步骤。初步了解可能 致危因素：生境退化或
9、丧失（人为所致）农业作物小农耕作； 生境退化或丧失（人为所致）基本建设居民安置 ；采捕药物维持生计或本地贸易 ；采捕药物国内贸易； 采捕文化、科研或休闲活动国际贸易。方案设想：方案设想：【一】总体研究实施方案组织切片技术学习红瘰疣螈标本采集查阅资料了解老师指导学习第一阶段采 集46月红瘰疣螈形态结构与保护的规律总结外形及结构与保护关系研究第二阶段采 集68月第三阶段采 集810月采集地点确定查阅资料红瘰疣螈组织切片制作红瘰疣螈形态结构解剖泌尿系统呼吸系统生殖系统神经系统骨骼标本制作 脑干剥离 神经系统 泌尿系统内部组织与保护关系的研究【二】本研究分以下几项工作1、组织切片及解剖技术培训学习一方
10、面以小组的形式进行培训，老师传授指导学习，掌握解剖及标本制作的操作技巧；另一方面查阅相关资料学习；2、红瘰疣螈活体标本采集为了能更具体的观察到不同时期红瘰疣螈的形态结构特征，所以采集大可分为三个阶段：第一阶段采集时间：2012 年 46 月（生殖前期）第二阶段采集时间：2012 年 68 月（生殖期）第三阶段采集时间：2012 年 810 月（生殖后期）采集方式：（1）通过当地居民帮忙采集；（2）通过护林员帮忙采集；（3）到哀牢山等周边环境亲自采集。采集地点：新平水塘，耀南，嘎洒，哀牢山等自然保护区。（注 1：采集时清晰记录采集地点、海拔及环境特征等等；注 2：采集需要雨衣、电筒及采集箱等）3
11、、养殖观察为了更方便的观察到红瘰疣螈对环境的适应特性，所以在把标本采集回来后，进行养殖观察。 （需要饲养箱、饲料等）4、标本解剖观察（1）对标本进行解剖，观察记录（拍照）红瘰疣螈内部结构特征，如脑干剥离、神经系统、泌尿系统等观察，结合组织切片进行分析观察；（2）制作骨骼标本（透明骨骼） ，了解红瘰疣螈的骨骼结构特征，为红瘰疣螈的整体结构分析了解提供依据；（3）对内部各结构系统做组织切片观察，如神经系统、泌尿系统、呼吸系统及生殖系统等组织切片制作；（4）制作内部结构标本及结构组织切片，为后期的结论提供依据。器材和仪器：动物切片机，毛笔，载玻片，盖玻片，烤箱，显微镜，染色缸；组织切片制作步骤：组织
12、切片制作步骤：(1）取材（神经系统组织、泌尿组织、呼吸组织及生殖组织）(2)固定(3)洗涤(4)脱水(5)透明(6)浸蜡(7)包埋(8)切片和附贴(9)烤片(10)染色(11)封固方法：1取材：动物处死后，快速取出所需的组织（消化组织、生殖组织、肺组织） 。取材的刀要锋利，严禁用手或镊子挤压，以免损伤组织。切取的组织块厚度一般为 0.51.0cm，大小 1.52.0cm，以免影响固定效果。2固定：将组织投入 10%的福尔马林、zenker 氏等固定液中固定，固定液的量大约为组织的 5 倍。固定时间约为 24h。3洗涤：流水缓慢冲洗，小组织可不冲洗，多次换水冲洗即可，一般为 1024 h。4脱水
13、：在有盖瓶子类进行，脱水一般采取上行梯度酒精，从 70%酒精至 95%酒精至无水酒精。还要注意组织在无水酒精内时间过久，容易发脆，一般约为 4 h。5透明：先将组织放入纯酒精与二甲苯等量混合液中半小时至一小时处理，再将组织放入二甲苯中透明，一般 1530 min，期间需要更换一次二甲苯，对着光线观察组织呈半透明或透明状态即可。6浸蜡：将透明后的组织放入熔化的石蜡内浸渍，浸蜡温度比比石蜡的熔高 2，浸蜡时间为 35 h，期间更换一次石蜡。7包埋、将熔化好的石蜡倒入包埋框，用加温的镊子将组织块切面朝下放入，将准备好的标签放在待凝固的石蜡面上，冷却。完全凝固后，修整蜡块。8切片和附贴：冷冻组织蜡块，
14、固定刀架、刀片和蜡块；切片：切片厚度：5 um；转速：4050 次/min；展片；捞片、烫片；45；切片过程中，固定好蜡块、刀片，注意刀与蜡块的（5） 。出现蜡片上卷、裂隙、刀痕等立即移动刀片和切片刀，转至刀刃锋利处。毛笔必须由下向上拨动，烫片时水温不宜过高。9烤片：将切片放在酒精灯烤片来回晃动。 10染色：二甲苯(10min) 二甲苯（5min）无水乙醇（1min）95%酒精 （1min） 85%酒精（1min）75%酒精（min）自来水洗（min）苏木精染液（10min）自来水洗（min）盐酸酒精（）11自来水洗（0.5 以上）12伊红染液（0.51min）13自来水洗（0.5min）14
15、酒精（min）15酒精（1min）16无水乙醇（2min）17无水乙醇（2min）18二甲苯（23min）19二甲苯（23min）11封固：切片经染色透明后，取出切片，擦去多余二甲苯，滴一滴中性树胶，将盖玻片盖于切片上。贴上标签并注明名称，编号。试剂试剂 1 1：乙醇，乙醇，,乙醇，乙醇，乙醇，无水乙醇，二甲苯，石蜡，切片树胶，苏木精，伊红，苦味酸， ；包埋框。场地：学校实验室；指导教师：有动物学知识，从事动物学实验教学及研究透明骨骼制作步骤：透明骨骼制作步骤：(1)剥皮去内脏选取体形完整的小型脊推动物，麻醉后剥去皮肤，挖出内脏，清水冲洗干净，用线缚于玻璃板上。(2)材料的固定将材料浸入 95% 酒精 710 d，每两天换一次酒精。如材料已用 510福尔马林保存过，需用清水漂洗后再浸入 95酒精中，使其充分固定。然后用清水冲洗已固定材料。也可将材料浸入 3重铬酸钾中 12 d，更换溶液至不再混蚀为止，以除去材料表面的脏物和脂肪粒块。取出材料清水冲洗，浸入 70酒精脱水，再浸入 95酒精 12 d。(3)透明将材料浸入 1氢氧化钾中 24 d，至肌肉呈半透明状并隐见其中的骨骼为止。(4)染色浸人茜素红酒精溶液（1 g 茜素红溶于 100 ml95酒精，搅拌呈黄褐色溶液。再与 900 ml1氢氧化钾溶液混合，成为紫色染色液）染色 1236 h，待全
