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1、第一节 细胞生物学的研究对象和范围 细胞生物学是从细胞整体、超微结构和分子水平上研究细胞的结构和生命活动规律的学科。细胞是一切生物的基本结构单位，它是由膜围成的能独立进行繁殖的最小原生质团。 显微结构：在光学显微镜下细胞的结构 亚显微结构：超微结构, 电子显微镜下细胞的结构 细胞的功能 物质的吸收与分泌、合成与分解、增殖与分化、衰老与死亡、信息传递与转导以 及遗传与变异等等 第二节 细胞生物学的发展简史 最早发现细胞的是 Robert Hooke 第一次（1674 年）观察到活细胞的是 A.V.Leeuwenhoek 1838 年，德国植物学家 Schleidon 提出：所有的植物体都是由细胞
2、组合而成的 1839 年，德国动物学家 T.Schwann 认为：动物体也是由细胞组成的，并肯定一 切生物体都是由细胞组成的 二人的观点就是著名的“细胞学说” （cell theory)， M.Schleidon 和 T.Schwann 同 时成为细胞学说创始人。 1855 年，德国病理学家 R.Virchow 提出：“细胞来自细胞” ，对细胞学说做了重 要补充。 “细胞学说”主要内容 细胞是多细胞生物的最小结构单位，对单细胞生物来说，一个细胞就是一个个体； 多细胞生物的每一个细胞即是一个活动单位，执行特定的功能； 细胞只能由细胞分裂而来。 原生质学说细胞是有膜包围的原生质团 1885 年，W
3、.Flemming 发现并提出有丝分裂 1905 年，J.E.Moore 等发现并提出减数分裂 O.Hertwig 1892 年发表了细胞与组织的著名著作 ，这一著作标志着细胞学 （Cytology）作为一门独立的生物学科的建立。第二章 细胞生物学研究方法 第一节 形态结构 一、光学显微镜 （一）普通光学显微镜 影响显微镜成像清晰度最关键的因素是显微镜的分辨率 分辨率是指显微镜能将相近的两个质点分辨清楚的能力 分辨率（resolution）公式：D= 0.61 / N.A. D 分辨率 光波波长 N. A. 镜口率（数字孔径） N. A. =N Sin /2 （二）特殊显微镜暗场显微镜 原理：
4、显微镜加装特殊装置，使直射光不能进入物镜，只允许被标本反射、衍射 的光线进入物镜 特点：视野的背景是暗的，样品是的边缘是亮的。 特殊装置：在聚光器中加装中央遮光板或者使用暗视野聚光器 相差显微镜（ phase contrast microscope） 二、电子显微镜 电子显微镜以电子束代替了可见光，大大提高了显微镜的分辨率，可以观察细胞 的亚显微结构 电镜与光镜的主要区别： 光学显微镜 电子显微镜 光源 可见光 电子束 介质 空气（香柏油） 真空 聚光镜 光学透镜 电磁透镜 分辨力 0.2um 0.1nm 放大倍数 1000 倍 百万倍 电子显微镜主要种类： 透射式电子显微镜(TEM) 主要用
5、于观察标本内部细微结构 扫描式电子显微镜（SEM) 主要用于观察标本表面形态结构 扫描隧道显微镜（STM） 电镜技术：冰冻断裂和冰冻蚀刻 冰冻断裂和冰冻蚀刻电镜技术目的：主要用于研究生物膜内部结构 主要步骤： 冰冻标本（-1000C 干冰或-1960C 液氮） ，冷刀断开标本（冰冻断裂） ，升温，冰 升华，断裂面结构暴露（蚀刻） ，表面喷一层蒸汽碳和铂，将组织溶掉，碳和铂的膜称复膜 （replica） ，电镜下观察复膜，复膜构造=标本构造 第二节 生物化学分析 一、组织化学法 *利用染色的方法进行原位分析 * 福尔根（Feulgen）反应：鉴定 DNA *PAS 反应（高碘酸席夫反应）：鉴定多
6、糖类物质 二者皆有醛基与 Schiff 试剂反应，生成红色化合物 二、免疫细胞化学 特异蛋白抗原的定性与定位 方法：原位分析 ；体外蛋白质分析 原位分析 ：免疫反应 ： 直接法：Ag+Ab*镜检；间接法：Ag+Ab1+ Ab2*镜检。*代表标记物 标记物可以为多种： 荧光素免疫荧光技术或称荧光抗体法，酶酶标抗体法，放射性同位素标记 放射自显影，铁蛋白标记，免疫胶体金技术 （二）体外蛋白质分析 蛋白质印迹法（Western blotting） 技术路线 ： （图） 样品制备样品分离样品转移免疫反应检测 蛋白质由 SDS 聚丙烯凝胶硝酸纤维素膜转移的过程即为印迹（blotting） *仪器：流式细
7、胞计flow cytometer *特点：细胞是高速运动的 *主要应用： 用于定量测定细胞中的 DNA、RNA 或某一特异蛋白的含量；测定细胞群体中不 同时相细胞的数量；从细胞群体中分离某些特异染色的细胞；分离 DNA 含量不同的中期染 色体；混合细胞分离 。 五、超离心技术（ultracentrifugation） 高速离心：1000025000r/min；超速离心：转速大于 25000r/min 沉降系数（ “S”Svedberg unit）: 单位离心场中溶质分子的沉降速度 。1S 相当于 110-13s 离心目的：分离细胞器与生物大分子及其复合物 离心种类： 分析离心：用于分析和测定制
8、剂中的大分子的种类和性质等 制备离心 差速离心：分离密度不同的细胞组分 密度剃度离心：精细组分或生物大分子的分离（介质蔗糖、氯化铯） 六、分子杂交技术 细胞内特异核酸的定性定位 光镜水平的原位杂交技术同位素标记或荧光素标记的探针 电镜水平的原位杂交技术 生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标 记结合 体外分析核酸的主要方法：Southern blotting 又称 DNA 印迹法；Northern blotting 又称 RNA 印迹法 分子杂交（molecular hybridization）是利用 DNA 高温变性、低温复性原理形成杂 交分子的过程 杂交分子形式：DNADNA；DNA
9、RNA；RNARNA 原位杂交是在分子杂交基础上建立起来的 七、PCR 技术 聚合酶链式反应；引物：寡核苷酸链；原料：d NTP；酶：DNA 聚合酶（耐高温） 第三节 细胞生理学技术 1、膜电位检测技术 细胞内外存在电位差（20100mV）称为膜电位，膜电位的变化反应了细胞的生 理变化 2、膜片钳位记录技术 主要用于检测单个特定离子通道性 质及变化 3、细胞电泳 细胞表面带有许多电荷，因而可以在外加电场的作用下移动 第四节 实验操作技术 （一）动物细胞培养 细胞培养主要方式 克隆培养（clonal culture）：克隆又称无性繁殖系或无性系 群体培养（mass culture） 体外培养细胞生长特点：单层细胞培养 贴壁生长；接触抑制现象 转鼓培养法 为了大量获取细胞而使细胞始终悬浮不贴壁的培养方法 细胞培养相关概念： 原代培养（primary culture）：从机体中取出细胞后直接培养，得到原代细胞 （一般指分裂 10 代以内的细胞） 。 分离细胞的主要方法 传代培养（subculture）：适合在体外进行的持续性培养，传代培养的细胞称 传代细胞。 细胞株（cell strain）在培养过程中仍然保持其特征（二倍体）及接触抑制的传代 细胞。 细胞系（cell line）在培养条件下发生突变后可以无限增殖的细胞群，接触抑制 丧失。 例：HeLa 细胞系；CHO 细胞系
