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1、园艺植物赖钟雄 研究员 刘生财 博士组织培养福建农林大学园艺植物生物工程研究所2第一节 植物组织培养的基本概念 植物组织培养（plant tissue culture）是指无菌和人工控制的环境条件下，利用适当的培养基，对离体的植物器官、组织、细胞及原生质体进行培养，使其再生细胞或完整植株的技术与方法，通常又称为植物离体培养（plant in vitro culture） 。一、植物组织培养的概念器官（organ)：根、茎、叶、花、果实实、种子组织组织 （tissue)：花药药、胚珠、胚、胚乳、形成层层 等 3二、植物组织培养的特点 在多数情况下是利用成分完全确定的人工培养基进行的 在封闭的容器
2、中进行培养，容器内气体和环境气体可通过瓶塞或其他封口材料进行交换； 组织培养的环境温度、光照强度和时间等 都是人为设定的 组织培养的其实材料处于离体状态 通过继代培养可以不断增殖 123456整个过程都是无菌条件下进行的 4细胞培养原生质体培养器官培养组织培养对植物体的各部分组织进行离体培养的方法。包括分生组织、形成层组织、薄壁组织、韧皮部组织、愈伤组织等。 对植物体各种器官及器官原基进行离体培养的方法。包括根、茎、叶、花、果实、种子等的培养。胚胎培养对植物成熟和未成熟胚以及具胚器官进行离体培养的方法。包括幼胚、成熟胚、胚乳、胚珠、子房等的培养。对单个细胞或较小细胞团进行离体培养的方法。常用的
3、细胞有性细胞、叶肉细胞、根尖细胞、韧皮部细胞等。 对植物的原生质体进行培养的方法。包括原生质体、原生质体融合体和原生质体的遗传转化体的培养等。三、植物组织培养的研究类型和任务 （一）研究类型5荔枝愈伤组织培养6苋菜茎段离体培养7柿子成熟胚的离体培养与快速繁殖8花烛叶片离体快速繁殖9大蒜根尖培养及植株再生10大蒜试管鳞茎诱导11人参细胞悬浮培养12非洲紫罗兰原生质体分离、培养及植株再生13（二）研究任务研究离体培养条件下，细胞、组织或器官所需营养条件和环境条件，细胞、组织或器官的形态发生和代谢规律，植物脱毒方法和机理，植物特别是一些难繁殖植物的大量快繁方法，细胞融合方法和机理，再生个体的遗传和变
4、异，种质资源的离体保存机理和方法等。14第二节 植物组织培养的形成与发展 1516细胞学说1902年，德国植物学家Haberlandt提出了植物细胞全能性学说。 植物的器官和组织可以不断分割，直至分到单个细胞而不影响细胞增殖的观点。并设想离体细胞具有再生完整植株的潜力。18组织培养作为一门技术，必须具有一定的程序性（技术模式）。在这一阶段植物组织培养建立了2个与培养技术有关的重要模式培养基模式激素调控模式。 191934年美国的White，利用番茄根建立了第一个活跃生长的无性繁殖系，发现B族维生素对培养的离体根生长具有重要作用。创立了White培养基。 1943年White发表了植物组织培养手
5、册的专著，使植物组织培养开始成为一门新兴的学科。P.R.White201948 年，Skoog和崔徵通过对烟草茎切段和髓培养组织的研究，确定了腺嘌呤生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一。1956年Miller等发现了激动素。控制器官分化的激素模式变为激动素生长素的比例关系。促进组培发展。F.Skoog211958年， Reinert和Steward对胡萝卜悬浮培养细胞和愈伤组织形成体细胞胚作了报道，用实验科学地论证了植物细胞全能性，标志着植物生物技术快速发展的开始。22Edward C. Cocking1960年，Cocking 等用真菌纤维素酶分离植物原 生质体获得成功。这是植物组织培
6、养的第二次突破 。 231960年G.Morel采用兰花的茎尖培养，实现了去病毒和快速繁殖两个目的。这是经过茎尖原球茎小植株的方式而再生的。 G.MorelMorel提出的这种离体无性繁殖方法，其繁殖系 数极高，很快被兰花生产者所采用，迅速建立起兰花 工业。241962年Marshing和Skoog在烟草培养中筛选出至今仍被广泛使用的MS培养基。1964年，印度科学家Guha 和Maheswari 在曼陀罗花药培养中首次由花粉诱导得到了单倍体植株。1971年，Takebe 等从烟草原生质体得到再生植株，首次获得原生质体植株再生成功。1972年，Carlson 等通过两个烟草物种之间原生质体的融
7、合，获得了第一个体细胞杂种植株。25在植物组织培养发展史中，我国学者做出多方面的贡献，除崔徵外，还有李继侗关于玉米等植物离体根尖培养的研究工作，罗士韦关于幼胚和茎尖培养，王伏雄等幼胚的研究培养工作；胡道芬花药培养；朱至清N6培养基等。26第三节 植物组织培养的应用及展望 植物组织培养研究领域的形成，不仅丰富了生物学科的基础理论，还在实际应用中表现出巨大的价值。植物组织培养的应用主要表现在以下几个方面： 27（1）试管苗快速繁殖 试管苗快速繁殖可以通过茎尖、侧芽、种子和愈伤组织再生 苗以及脱毒苗等进行。最早研究试管苗繁殖的有Knudson （1992）研究了兰花种子的非共生萌发，中国罗士韦教授在
8、1945年率先进行的植物茎尖培养，对植物生物技术发展作出了重要贡献。28植物离体快繁是植物组织培养在生产上应用最广泛、产生较大经济效益的一项技术。离体快繁的特点是繁殖系数大、周年生产、繁殖速度快、苗木整齐一致等。对一些繁殖系数低、不能用种子繁殖的“名、优、特、新、奇”的作物品种的繁殖，更为重要。2930通过植物离体快繁获得整齐一致的蝴蝶兰 31蝴 蝶 兰32石斛兰33石斛兰34卡 特 兰 35卡 特 兰36兜 兰37兜兰 38兜兰39兜兰40（2 2）花药）花药、胚胎培养、胚胎培养 花药或小孢子和未成熟胚珠培养是获得纯合杂种的 主要途径。 Vasil（1957）最早对洋葱花药的培养进行了研究，
9、 到1964年，Guha和Maheshwari获得了曼陀罗植物花 药培养来源的单倍体植株，而从未成熟胚珠培养产 生单倍体植株直到1976年才成功。朱至清教授设计 的N6培养基，适合水稻和其他禾本科植物花药培养 ，在世界各国实验室中得到应用，促进了花药培养 的研究。4142远缘杂交中，可把未受精的胚珠分离出来，在试管内用异种花粉在胚珠上萌发受精，产生的杂种胚在试管中发育成完整植株，此法称为“试管受精”。 用胚乳培养可以获得三倍体植株。43利用组织或细胞的大规模培养，有可能生产出人类所需要的一切天然有机化合物，如蛋白质、脂肪、糖类、药物、香料、生物碱及其他活性化合物。44（3 3）次生代谢）次生代
10、谢产物产物 在1942年，Gautheret就报道了组织培养中的次生代谢产物，但直到Kaul和Staba（1976）发现阿密茴（Ammi visnaga）培养细胞的次生代谢产物与整体植物相等后，通过细胞培养生产有用化合物的研究才得以发展。4546（4）体细胞变异47无论是愈伤组织培养还是细胞培养，培养细胞均处在不断分生状态，容易受培养条件和外界压力影响而产生诱变，从中可以筛选出对人们有用的突变体，从而育成新品种。 植物组织培养中体细胞变异的研究起步较晚，Carlsin（1970）进行生物化学诱变并筛选出烟草突变体。1981年，Larkin和Scowcroft提出体细胞变异的概念。据Malusz
11、ynshi等（1995）统计，利用组织培养诱导、筛选和培育的突变体品种有1700多个，涉及154种植物。48目前已经通过该法选育 出一些香蕉的抗性品种49（5）原生质体培养 原生质体培养在Cocking（1960）利用纤维素酶和果胶酶降解细胞壁获得产量高的原生质体之后发展起来。50通过原生质体融合，可部分克服有性杂交不亲和性，而获得体细胞杂种，从而创造新种或育成优良品种，这是组织培养应用最诱人的一个方面。 目前已获得 40 余个种间、属间、甚至科间的体细胞杂种、愈伤组织，有些还进而分化成苗。5152（6）脱毒苗的培育 很多农作物都带有病毒，特别是无性繁殖植物。 自然界中存在很多病毒，已发现的病
12、毒超过500种，很多植物易受病毒侵染。长期无性繁殖的植物，在繁殖过程中病毒可通过营养体进行传递，逐代累积，使病毒病的危害更为严重。53 病毒在植物体内的分布是不匀衡的，在受侵染的植株中，顶端分生组织一般说是无病毒的，或者只携带有很低浓度病毒。 茎尖脱毒培养已成为植物脱毒育苗的主要方法。 54马铃薯脱毒苗55（7） 植物种质资源的离体保存已有相当数量的植物物种在地球上消失或正在消失。节约人力、物力和土地便于种质资源的交换和转移56Longan FEC maintaining for 16 yearsLongan FEC maintaining for 16 years57Induction an
13、d maintenance of FEC Induction and maintenance of FEC (Friable embryogenic callus) in longan (Friable embryogenic callus) in longan (Lai 1994)(Lai 1994)（8） 人工种子人工种子（artificial seed）的概念是1978年美国生物学家Murashige首先提出的，它是指植物离体培养中产生的胚状体或不定芽，被包裹在含有养分和保护功能的人工胚乳和人工种皮中，从而形成能发芽出苗的颗粒体。5859厚荚相思人工种子60存在问题虽然人工种子的研究已有二十多年，但一些难题仍然未能很好解决，如人工种皮、防腐、贮藏运输、在体外条件及类似土壤的底物中转化率较低、制作成本高、主要靠手工操作等。这些难题的解决又涉及细胞工程学、植物胚胎学、植物生理学、生物化学、高分子化学、机械加工等技术领域，要求的技术水平较高，所以，目前人工种子的研究仍处于探索阶段。 61
