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1、KKME-专业医学搜索引擎 http:/ COX和和 COX表达的变化表达的变化作者：王小花 高静 张同霞 赵秀鹤 刘学伍 迟兆富 作者单位：山东大学齐鲁医院神经内科，山东 济南 250012【摘要】 目的 探讨癫痫对大鼠海马线粒体细胞色素氧化酶(COX)的 mtDNA 和 nDNA 编码亚基、表达的影响。方法 成年雄性 Wistar 大鼠随机分为生理盐水对照组、癫痫持续状态(SE)后急性期(3 h)、静止期(7 d)、慢性期(45 d)组和注射匹鲁卡品(PILO)但未出现 SE 组。免疫组化并荧光实时定量 PCR 检测海马线粒体COX、阳性染色及其 mRNA 的表达。结果 COX阳性细胞数在
2、 SE 后 3 h 明显增加，7 d 降到对照组水平，45 d 显著降低;COX 阳性细胞数 SE 后 3 h 稍有增加，但较对照组无显著性差异，7 和45 d 时 COX染色变化与对照组相似;注射 PILO 但未出现 SE 组COX、的表达与对照组类似。COXmRNA 在 SE 后 3 h 表达明显升高(P0.001)，7 d 时降到对照水平，45 d 显著降低(P0.001);COX mRNA 在 3 h 时表达较对照组升高，但差异无显著性，7 和45 d 时下降至对照组水平。注射 PILO 但无 SE 组与对照组结果类似。结论 颞叶癫痫海马 COX 功能紊乱与痫性发作相关，线粒体编码的基
3、因更易受痫性发作的影响。【关键词】 细胞色素氧化酶;癫痫;海马;线粒体基金项目：山东省“十一五“重大攻关计划(2005gg3202069)Changes of expression of mitochondrial cytochrome oxidase KKME-专业医学搜索引擎 http:/ and in the hippocampus of pilocarpine-treated ratsWANG Xiao-Hua，GAO Jing，ZHANG Tong-Xia,et al.Department of Neurology，Qilu Hospital of Shandong Universi
4、ty，Jinan 250012，Shandong，China【Abstract】 Objective To investigate the effects of epilepsy on expression of cytochrome oxidase(COX) subnuits(COX) and (COX ) encoded by mtDNA and nDNA respectively in rat hippocampus.Methods Male Wistar rats were divided randomly into saline control, acute period(3 h),
5、silent period(7 d),chronic period groups(45 d) after status epilepticus(SE) and group which received pilocarpine (PILO) but did not develop SE.The expressions of COX and COX in rat hippocampus were detected respectively by immunohistochemical staining and real time quantitative PCR.Results An signif
6、icant increase in COX staining was observed in neuronal cell bodies distributed throughout the hippocampus(CA1，CA2，CA3，dentate gyrus) of rats killed 3 h after SE，when compared to the saline-treated group on day 7 after SE，the immunoreactivity was slowly reduced and the immunoreactivity of cell bodie
7、s was restricted predominantly to the dentate gyrus，and CA3 regions of the hippocampus.The chronic period (45 d) showed decreased staining with the findings indicating neuronal degeneration such as condensation of cell bodies，vacuolization and rearrangement of KKME-专业医学搜索引擎 http:/ cell layers in the
8、 CA3 of the hippocampus. COX mRNA showed significantly increased expression in the group at 3 h after SE(P0.001)when compared with the control group.The silent group presented similar levels of expression of COX，but the chronic group showed significantly decreased level in respect to the control gro
9、up(P0.001).Slightly increased，but not significant expression of COX was found in acute(3 h) group，then decreased slightly and remained constant during the following days of epilepsy compared with saline-treated animals.Animals that did not respond to PILO in this study showed similar results with th
10、at of control group.Conclusions Dysfunction of COX in the hippocampus are associated with prolonged seizure during experimental temporal lobe epilepsy and mitochondria are more vulnerable to epilepsy.【Key words】 Cytochrome oxidase;Epilepsy;Hippocampus;Mitochondria癫痫是临床上最常见的神经系统疾病之一，国内外对其发病机制进行了大量研究1
11、 。以往研究认为，癫痫导致的神经元损伤主要是由兴奋性氨基酸活动过度引起的2 。近年有学者提出，中枢神经系统线粒体功能障碍可导致癫痫发作，癫痫发作亦可引起线粒体损伤2，3 。线粒体是哺乳动物胞质中唯一含有遗传物质的细胞器，线粒体呼吸链中的 5 个酶复合体均由线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)和核 DNA(nuclear DNA，nDNA)KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 和 nDNA 基因的表达对维持线粒体的正常结构和功能十分重要。细胞色素氧化酶(cytochrome oxidase，COX)是线粒体呼吸链末端的限速酶，由 mtDNA 和 nDNA 共同编码的
12、 13 条亚基组成(COX、和由 mtDNA 编码，其余由 nDNA 编码)。既然癫痫与线粒体有互为因果的关系，在癫痫的不同时程中，线粒体在基因水平有何变化，线粒体基因与核基因的表达协同性如何，国内外此领域研究尚无定论。本研究通过观察癫痫状态(status epilepticus，SE)后不同时程大鼠海马线粒体 COX(mtDNA 编码)和 COX(nDNA 编码)在基因和蛋白水平的表达变化及协同性，初步探讨线粒体在分子水平与癫痫的关系及核、线粒体基因在癫痫中的协同水平。1 材料与方法1.1 材料 DAB 免疫组化试剂盒(北京中山生物技术有限公司);LightCycler 2.0 实时定量 P
13、CR 仪(Roche);匹鲁卡品(Sigma);提取RNA 和逆转录试剂盒(Promega);SYBR Green 荧光染料试剂盒(Takara);山羊抗人 COX(Santa Cruz),小鼠抗牛 COX(Molecular Probe);其余试剂为国产分析纯。1.2 引物设计 引物由上海英骏生物技术有限公司合成，序列如下：GAPDH(内参 389 bp)：上游5TCAACGGCACAGTCAAGG3，下游5TGAGCCCTTCCACGATG3;COX(295 bp)：上游 5CACCCGAGCCTACTTTAC3，下游KKME-专业医学搜索引擎 http:/ (331 bp)：上游5ATG
14、GGAGTGTTGTGAAGAGTG3，下游 5 TCAAAGGTATGAGGGATGG3。1.3 动物分组与制模 成年雄性 Wistar 大鼠 50 只，160180 g，78 周龄(山东大学实验动物中心提供)，随机分为 5组：对照组，SE 后急性期(3 h)、静止期(7 d)、慢性期(45 d)组和注射匹鲁卡品后未出现 SE 组(PILO 组)，每组 10 只，每组中 4 只用于免疫组化，6 只用于荧光实时定量 PCR。向实验组大鼠腹腔注射 10%匹鲁卡品 350 mg/kg,并于注射匹鲁卡品前 30 min 腹腔注入东莨宕碱 1 mg/kg，以拮抗其外周胆碱能反应。急性期诱发发作后每天逐
15、只观察动物有无自发性发作。对照组注射等量的生理盐水代替匹鲁卡品。1.4 大鼠惊厥分级及 SE 判断标准 按 Racine4标准判定癫痫发作的程度：1 级:动须、咀嚼;2 级:节律性点头;3 级:一侧前肢阵挛;4 级:站立伴双前肢阵挛;5 级:4 级+跌倒伴全身抽搐。SE 判断标准：出现 4 级以上的发作并保持连续的运动性发作(如面肌抽搐、节律性点头、肢体阵挛)至少 30 min，其间不伴有正常的行为(如理毛)。在惊厥发作持续 2 h 时，腹腔注射地西泮(10 mg/kg)以终止发作。1.5 实验方法1.5.1 COX、阳性细胞数 各实验组大鼠在 SE 后相应的时间点(分别为 3 h、7 和 45 d)，经心脏生理盐水-多聚甲醛灌注取脑，冠状切取视交叉与视乳头间 25 mm3 组织块，制作冰冻切片。将切片用 PBS 洗 3 次，甩干，加山羊血清封闭液，加入 COX、一KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 1100，4冰箱过夜，加生物素标记二抗，加标记过氧化物酶的链霉素-亲和素复合物，DAB 显色。光学显微镜下观察结果的标准：COX 阳性细胞被染成棕黄色。每个时间点每只大鼠随机取 3 张切片，于高倍(400)镜下选定海马组织 CA1、CA3 区，随机取 5 个视
