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1、 1997211226收稿 1998203212修回3国家自然科学基金资助项目(No139170294)33现在通讯地址:军事医学科学院毒物药物研究所,北京100850生理学报, 1999年2月, 51 (1) , 3137 31 Acta Physiologica Sinica胞内记录猫体感皮层内脏伤害性 感受神经元的电生理特性3陈京红33滕国玺(中国医科大学脑研究所神经生理研究室,沈阳110001)摘 要 为了从细胞水平探讨皮层内脏伤害感受的特性及机制,本文应用细胞内电位记录技术,观察了猫体感皮层内脏大神经皮层代表区的851个神经元对电刺激内脏大神经的诱发反应及电生理特性。 其中412个单
2、位为内脏伤害性感受神经元,其自发放电有多种形式,根据诱发反应现象分为特异性和非特异性伤害感受神经元,内脏伤害性诱发反应分为兴奋性反应(5117 %)、 抑制性反应(31131 %)及混合性反应(17 %)三类。 在形式上具有潜伏期长、 反应形式复杂等特点。 实验发现85个神经元为内脏及肋间神经的会聚反应细胞。 部分神经元用神经生物素进行细胞内电泳标记以显示功能细胞所在层次及形态。 结果说明皮层体感神经元具有内脏伤害性感受的作用,并从细胞及突触后电反应特点上探讨了内脏痛的感受机制。关键词:皮层体感区;内脏;伤害性感受;细胞内记录;标记;痛学科分类号: R33818 , R338125内脏痛是与躯
3、体痛性质不同的一种伤害性感觉,也是最普遍的临床症状之一,它给患者 带来巨大的痛苦。 内脏痛的研究起步不晚,因研究难度较大,与躯体痛相比其发生机制及中枢传导的研究进展相当缓慢1,且多限于对外周传入及脊髓节段的研究。 因内脏痛觉是一种 主观体验,因此伤害性冲动必然上升到大脑皮层而进入意识领域,但迄今为止,用细胞内记 录的方法支持这种论断的证据十分有限,仅限于皮层内脏伤害性感受的诱发电位2及胞外 放电的研究3 ,4,而对于皮层体感区内脏伤害性单个感受神经元的电生理及形态特性的系 统研究仍未见报道。目前痛觉的皮层感受日益引起重视,而感觉皮层对功能的理解在极大程度上取决于不 同皮层神经元的性质,能否从单
4、一内脏伤害感受细胞的反应模式去解释内脏痛复杂的感受 特性,是一个令人十分感兴趣的问题。 所以,本课题用在体微电极细胞内记录技术,研究皮 层体感区(primary somatosensory cortex , S)中内脏大神经代表区的内脏伤害性感受神经 元的电生理特性,并对部分神经元用神经生物素(neurobiotin)进行标记,从单细胞的机能特性及与形态结合的角度,联系内脏痛感受的特殊性探索内脏痛传导的皮层内感觉机制,为 皮层在内脏痛感受中的作用提供新的科学依据。1 材料和方法111 实验动物准备 选成年健康猫22只,体重210312 kg。 前肢局麻条件下静脉插 1995-2005 Tsin
5、ghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.管,建立给药途径。 戊巴比妥钠(40 mg/ kg)静脉麻醉,于左侧背部腹膜外暴露内脏大神经 (greater splanchnic nerve , GSN ) ,于其向中端置双极银丝保护刺激电极(极间距离215mm) ,置神经蜡和明胶海绵以绝缘并吸收体液,防止因电流外溢引起的周围组织兴奋所致 的躯体性传入的影响。 部分实验分离1112肋间神经,亦置刺激电极,并用神经蜡保护之。 暴露皮层S 区GSN代表区(AP , 23 mm; LR , 4 mm)5,并用50 固定熔点的蜡覆盖脑
6、表面以防干燥及脑波动。 做小脑延髓池引流以降低脑压。 维持肛温于3738,实验过程中按 时补充麻醉药,部分实验用三碘季铵酚制动6。112 电生理记录 细胞内记录的玻璃微电极尖端直径 015m ,内充3 mol/ L KCl溶 液,同时作胞内标记时内充神经生物素(Sigmar产品)的醋酸钾溶液。 于右侧S 中GSN代 表区,选放电形式稳定、RP绝对值大于40 mV、 电极停留5 min以上的神经元进行观察,不符合条件者舍弃。 将引导的细胞内电位经MEZ28201生物放大器输入VC210示波器,观察 神经元的电活动同时作磁带记录, ATAC2350机处理数据,并由X2Y记录仪描记实验结果。 刺激G
7、SN的参数为波宽015110 ms ,强度016110 mA的单方波电流,此强度足以 使该神经中A和C纤维兴奋,并产生瞳孔变化等痛反应,刺激反应可被吗啡抑制。 观察完电生理现象后,某些神经元进行神经生物素电泳,其参数:强度13 nA、 波宽为220 ms、 频率1 Hz的正电流,时间为315 min。 实验完毕后,于左心室灌流生理盐水和 固定液(多聚甲醛和戊二醛) ,取脑块于固定液中放置过夜,翌日做冠状连续切片(70m)。113 组化染色检查 将切片经带有HRP的Strepavidin处理后, PBS冲洗, DAB呈色反 应,酒精、 二甲苯系列脱水透明,光镜检查分析,部分刺激相关神经元用中性红
8、染色进行组 织学定位(如图1为所标记的皮层体感区第 层细胞)。114 统计方法 采用组间对照,数据用t检验统计处理,P 70 mV且呈非活动静 息状态神经元。S 区GSN代表区同一柱状结构细胞放电形式、 刺激诱发反应均近似。211 皮层内脏伤害性感受神经元电生理特性21111 VNNs的自发生物电活动形式 皮层GSN代表区VNNs自发电活动形式呈多种 多样,但主要有下列6种模式(见图2)。图 2 S区VNNs的自发生物电活动模式 Fig12 Modes of biological electric activities ofvisceralnoci2 ceptive neurons in Sa
9、rea A :Non2discharges in resting state1B : Synaptic noise activites.C:Occasionally discharges.D :Continous tonic discharges. E:Rhythmic high frequence discharges. F:Pair2spikes.在细胞内电反应记录过程中,对VNNs和NVNNs的部分电学特性及深度分布进行比较,发现两者存在某些差别,如表1所示。NVNNs的静息电位绝对值高于VNNs。 分别随机统计100个VNNs或NVNNs ,发现VNNs中具有自发放电性质的细胞数及放电
10、频率均高于NVNNs ,但放电幅值无显著差异。 在皮层深度分布上, VNNs相对深于NVNNs。表1 猫皮层S 区VNNs和NVNNs部分特性的比较Table 1 Comparison of partial characterisitics between VNNs and NVNNsVNNs (n) NVNNs (n)Statistic analysisResting potential / mV- 5012410108 (n=100)- 561701519033(n=100)P 0105Depth distributed H/m118411274418 (n= 45)88010058111
11、033(n=25)P 0101xs.33P 0101 significantly different from VNNs.21112 VNNs的诱发反应 (1)阈强度:根据GSN刺激强度不同, NSVNNs产生不同反应, 014 mA以下时只出现短潜伏期的诱发反应,随强度增加出现长潜伏期的反应成分,且EPSP上锋电位增加,当强度达到016 mA以上时,反应成分不再增加,提示内脏痛伤害性反应阈值为016 mA ,本研究均采用115倍阈上电流刺激GSN作为内脏痛伤害性刺激。(2)VNNs诱发反应特性:诱发反应分为兴奋性(51170 %)、 抑制性(31131 %)及混和性(1710 %)等。 对无
12、或仅有少量自发放电的VNNs ,阈上刺激时呈潜伏期固定的诱发反应,而高频自发放电的神经元诱发反应整合后呈诱发锋电位、 增频、 高频抑制及放电模式转换等现象。诱发反应有兴奋性突触后电位(EPSP)和抑制性突触后电位(IPSP) ,本实验观察到从单一到多成分的各种反应,一般短潜伏期成分是小于35 ms的反应,第二成分多在70 ms左右,第三、 第四成分分别在140和230 ms左右。还发现短潜伏期成分如单个EPSP为(30183331期 陈京红等:胞内记录猫体感皮层内脏伤害性感受神经元的电生理特性 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd.
13、 All rights reserved.28100) ms (n= 30)、 单个IPSP为(35156155) ms ,(n= 10)均比实验曾看到的S 区躯体隐 神经反应潜伏期单个EPSP(51774108) ms ,单个IPSP(111446146) ms ,n= 10为长(P图 3 不同VNNs对刺激内脏大神经所诱发的各种兴奋性反应 Fig13 Excitatory responses in variety of VNNsevoked by stimulating GSN A :Uni2EPSP.B :Poly2EPSPs.C:Spikes on EPSP. D :Uni2spike
14、.E:Spikes on EPSP in spontaneous dis2 charges condition.F:Increased discharges (upper curve as control)10101) , SVNNs的痛反应潜伏期如单一EPSP (6816714131) ms ,n= 15也明显长 于躯体神经伤害性刺激潜伏期 (4510011178) ms ,n= 10 (P 0101) , VNNs的反 应时程 (251788197) msn= 50也长于躯 体反应 (191397195) msn= 20 (P0101)。此 外,VNNs中IPSP出 现 率(1812 %)
15、大于躯体伤害性感受神经元的IP2SP的出现率(913 %)。 其反应形式:(1)兴奋 性反应:包括刺激诱发的EPSP及其上的锋 电位发放、 诱发锋电位或增频反应。 在增频 反应中,兴奋性后发放较多,持续性后续增 频效应能持续几秒到几十秒,本研究中有21个此类型反应神经元(见图3)。(2)抑制 性反应:包括局部超极化(IPSP)和锋电位 抑制及减频反应。 锋电位抑制可使自发放电 产生抑制甚至使自发锋电位消失(见图4)。(3)混合性反应:包括EPSP2IPSP序列反应神经 元43个,先抑制后兴奋性17个及先兴奋后抑制性神经元12个。图 4 不同VNNs对刺激内脏大神经诱发的抑制性反应 Fig14
16、Inhibitory responsesof VNNsin S evoked by stimulating GSN A :Uni2IPSP.B :Double IPSPs.C:IP2 SP (in discharges) .D :Poly IPSPs(in dis2 charges) .E:Discharges vanished gradual2 ly.212 吗啡对GSN诱发的S 区VNNs反应的影响 对3次检查潜伏期和反应形式都较稳定的神经元,静脉注射1 mg/ kg吗啡, 1 min后长 潜伏期放电消失,3 min后诱发反应均消失, 20 min后部分神经元可以恢复。说明吗啡可抑制VNNs的反应,观察10例效果基本相同,但有些神经元在反应尚未恢复前电极脱出细胞。213 内脏与肋间神经伤害性刺激反应在S 区同一神经元的会聚现象 对263个神经元观察
