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1、浙江临床医学 2 0 0 9年 8月第 1 1卷第 8期 核苷类药物抗乙型肝炎病毒 耐药的研究进展 毛利君综述 吕铁锋审校 对 大多数 慢性乙型肝炎 ( 慢 乙肝 ) 患 者而言 ， 抗病 毒治 疗是改善患者 预后 、 提高生活质量 的主要措施 ， 而核苷 类药 物的问世成为慢乙肝抗病毒治疗的一个重要里程碑。慢性 乙型肝炎患者采用核苷类药物治疗能有效抑制 H B V复制 ， 使肝功能恢复、 肝组织学改善， 防止或延缓慢性乙型肝炎进 展为肝硬化、 肝功能失代偿、 肝细胞癌。但核苷类药物存在 需要长期治疗， 疗程不易确定， 停药后易复发等缺点 ， 特别 是易 出现耐药 变异 ， 引起 反 弹 ，
2、少 数病 例 出现 肝 功能 失代 偿。因此， 慢性乙型肝炎的耐药问题成为医者和患者共同 十分关注的问题。 1 HB V耐药定义与类型 HB V对某种药物的耐药性 ， 一般是指这种药物对病毒 的抑制作用减弱或无作用， 其基础是 H B V基因发生变异。 HB V耐药分为 3种类型。( 1 ) 基因耐药： 指 H B V基因组某 些位点发生变异而导致耐药。这种变异与耐药性有直接因 果关系 ， 通过 这些 变异位点的核苷 酸序 列检测 可判断 H B V 有无耐药性。( 2 ) 表型耐药 ： 指用体外细胞培养方法 ， 直接 测定 某种 药物对 H B V的抑制作用 ， 通常以抑制病 毒复制率 (
3、I C 5 0 ) 5 0 所需的药物浓度来评估其敏感性。I C 5 0值 增加 1 O倍者为耐药。( 3 ) 临床耐药： 指临床出现病毒复制不能 被抑制， 或 H B V复制一度被抑制后又出现 H B V D N A水平 重新升高 ， 可伴有或无 A I J T升高， 即临床上抗病毒治疗应 答的反弹类型。诊断临床耐药时必须排除核苷类药物治疗 中因其他原因引起 AI JT升高， 如依从性差 、 服用损肝药物、 酗酒、 重叠其他病毒感染、 疾病本身波动或正处于 H B e A g 血清转换期等， 最好进一步作基因耐药或表型耐药分析。 2 H B V耐药 的产生 2 1 H B V复制特点H B
4、V是一种 D N A病毒 ， 它通过 逆转 录前基因组 R N A来不断复制。逆转录酶与 D N A聚合酶不 同， 它缺乏校正功能。所以， HB V复制过程 的出错率要高 于其他 D N A病毒。高出错率加上高复制量( 每天复制 1 0 一l 0 “ 个病毒) ， 意味着每时每刻任何变异株 的产生都是可 能的。H B V的一些位点突变会降低病毒的复制能力， 而有 些位点突变( 或加上代偿性突变) 并不降低病毒复制率， 从 作者单位 ： 3 1 0 0 5 3浙 江中医药 大学 ( 毛利君 在职研究生 ， 现在 杭州市第六人民医院感染科工作) 8 71 而显示出耐药性。这些随机突变常在服用核苷类
5、抗病毒药 物之前就已经存在， 但也可在用药过程中发生突变。H B V 基 因组 中的突变是随机 发生 的 ， 而具 有生 物学 优势 的变异 株在病毒复制过程中占主导地位 ， 在宿主与病毒相互作用 方面 ， 选择性变异株 比野生株具有更 大的优 势 。 2 2 H B V准种动力学变化H B V准种 的进 化依赖选 择压 力( 如抗病毒药物和免疫应答引起的压力) 、 变异导致的复 制适 应性 以及是否有未被感染 的肝细胞为具有更强适应 性 的耐药变异 株提 供复 制空 间 J 。在 没有 药 物压力 的情 况 下， 耐药变异株的复制能力常低 于野毒株， 因此治疗开始 时， 肝细胞大部分被野毒株
6、所感染， 只有一小部分细胞内存 在着耐药变异株。使用抗病毒药物后宿主体内环境发生了 改变 ， 这时变异株的复制适应性超过了野毒株， 选择压力对 变异株更有利。 3 H B V耐药的临床 检测 随着抗病毒药物 的发展 ， 耐药 的检 测 已成为越 来越 重 要的问题 ， HB V耐药 的动力学变化 在 以拉米夫定 治疗 的过 程中可以很清楚地观察到。在拉米夫定开始治疗时， 可观 察到血清 HB V D N A的下降， 接着患者进入病毒被抑制到 最低程度的维持阶段， 该阶段是临床治疗的关键。这时用 灵 敏的检测方法可较早地在 H B V D N A上升 之前检 测到 耐 药株。通过早期检测变异株
7、， 可尽早改变治疗方法以避免 H B V D N A的上升和可能 的肝病恶 化 。 3 1 H B V D N A的载量检测 目前国内外有许多商售 的 H B V D N A检测试剂， 其检测的灵敏度及范围相差很大， 其中 罗氏公司的C o b a s T a q M a n最低检测水平达 5 0拷贝 n il ， 其 灵敏性和特异性均较 好。要获得抗 病毒疗效 最准确 的评 价 和观察患者病毒载量 的动 力学改变 ， 用 以监测 D N A的检 查 方法既要有较低 的检测下限 ， 又要有较 大的检测 范围。这样 可以使医师观察到药物在患者体内作用的速度和强度， 而且 可以及时发现病毒突破并采
8、取干预措施 。此外， 同一份样 本经 2个 不 同的检 测方 法检 测得 出 的结果 可相 差 1 l o g l 0 I U m l 。因此， 在临床医疗和临床试验中， 每例患者 都应当始终使用同一检测方法。然而这在需进行长期随访 和具有远期治疗终点的临床试验中可能是困难的， 因为在评 价治疗阶段检测方法会经常改变。至于检测的频率可根据 所用药物、 已治疗时间、 患者病情等决定。对核苷类药物初 治患者来说， 恩替卡韦、 阿德福韦第 1 年没有耐药的发生， 第 2年可每3 6个月检测 1 次； 采用拉米夫定治疗的患者以及 8 7 2 伴有肝硬化或进展性肝病的患者应适当缩短间隔时间。 3 2 基
9、 因检测基 因检测有赖于 D N A测 序或者杂交 。 目 前使用的方法主要包括直接测序、 聚合酶链式反应 一限制 性 片段长度多 态性 ( P C RR F L P ) 、 序列 特异 性 P C R、 线性 探针杂交 技术 及基 因芯片 。( 1 ) 直接测 序法 ： 其原理 简单 ， 重复性好 ， 可以 同时检测多个位点 的突变 ， 是 目前在临床上 应用最多 的一 种方 法 ， 已经有商业化 的试剂盒销售 ， 也可 以 在各实验室自行完成， 但操作步骤多 ， 检测周期长， 费用较 高， 需要有一定经验的专业人员操作， 对病毒载量有一定的 要求。( 2 ) 聚合酶链式反应 一限制性片段长
10、度多态性( P C R R F L P ) 检测法 ： 该方法具有较强 的灵 敏性 ， 可检测数量 占 H B V准种池 5 的耐药变异株 ， 曾被国内外众多实验室应 用于 L A M耐药变异检测工作中， 近来国内也建立了基于该 技术 的 A D V耐 药变异检 测方 法。然而 P C RR F L P只能检 测单位点变异， 仅用于少数耐药变异位点监测时， 尚不失为 一种简便、 快速且廉价的方法。但随着多种核苷类药物的 相继 问世 和 H B V耐药变异位点的不断出现 ， 该 方法将难 以 胜任。( 3 ) 线性探针杂交技术 ： 本方法基于不同的靶 目标 杂交到一组短的膜限制性寡核苷酸探针来区
11、别野毒株序列 和那 些已知的耐药变异株 ， 当引起耐药 的突变 株 只 占总病 毒数的很小比例时， 就能检测到正发生的耐药 ， 其敏感性 好。但由于其寡核苷酸探针必须是针对已知的突变位点， 一个 变异位点可能需要多个探针 ， 无法测得未知 变异 ， 得 到 的信息有限， 且价格昂贵。( 4 ) 基因芯片技术 ： 将寡核苷酸 片段作为探针有序及高密度地固定于玻片等载体上 ， 与荧 光标记的待测核酸按照碱基配对的原则进行杂交， 经激光 共聚焦检测信号并由计算机分析结果。作为一种高通量的 D N A分 析技 术 ， 可 以对 众多疾 病相 关基 因、 耐药 分 型及 多 种疾病病种进行并行的高时效分
12、析， 国内外均有应用于 Y M D D变异检测的成功报道， 特别适用于高通量信息的筛 查 ， 是今后发展 的一个重点方 向。 4 H B V耐药的临床 处理 处理措施包括： ( 1 ) 对核苷类药物初治患者， 如果经济 条件允许， 应考虑首选恩替卡韦或替 比夫定进行抗病毒治 疗 ； ( 2 ) 进行规范 的长期治 疗 ， 目前各种 核苷类 药物 的治疗 终点均可参照慢 性 乙型肝 炎 防治 指南 中对拉 米 夫定 治 疗的建议方案执行； ( 3 ) 定期检测 H B V病毒载量， 出现 H B V D N A反跳 l 1 o g l 0 ， 或 由 阴性 转 为 阳性 时 ， 应 考虑发 生病
13、毒耐药的可能 ； ( 4 ) 有条件时应针对性地进行耐药基 因变异检查； ( 5 ) 对已经发生核苷类药物耐药的患者， 应及 时换用 加用与已用药物无明显交叉耐药的其他抗病毒药 物； ( 6 ) 可通过监测短期治疗后病毒载量降低的情况预测 疗效 ， 及时判断患者是 否适合 继续用该 药物进 行抗 病毒治 疗 ； ( 7 ) 通过联合用药减少耐药发生 。 联合用药在抗 HI V感染 中取得了较好疗效， 但在抗 H B V感染中， 尚未作为常规方法应用， 我国慢性乙型肝炎 防治指南对此也未做推荐， 但已有多项临床研究表明， 拉米 逝江l临 床医学 2 0 0 9年8 月第 1 1 卷第 8 期 夫
14、定联合长效干扰素或阿德福韦治疗慢乙肝虽然不能提高 持续病毒学应答( S V R) 率， 但可以显著减少耐药变异发生， 拉米夫定治疗 1年后的耐药变异发生率从 2 0 左右降低 到 5 。在核苷类药物 中， 拉米夫 定与阿德福 韦具 有 较好 的互 补性 ， 可相互抑制对另一种药物耐药的变异株 ， 无 重叠毒性 ， 2种 药物联合应用 治疗拉米夫 定耐药 患者 ， 可预 防阿德福 韦耐药 。因此 ， 有必 要开展 在拉米 夫定 耐药变 异 发生前加用阿德福韦的临床研究 。 通过合理用药可 以减 少或延 缓耐 药变异 的发生 ， 通 过 临床监测可以及时发现病毒耐药。应尽可能在基因型耐药 或病毒耐
15、药阶段就采取有效的干预措施， 避免或减轻临床 耐药 引起 的肝 细胞再损伤 。 参考文献 1 C h i n R，S h a w T，T o r r e s i J ，e t a1I n v i t r o s u s c e p t i b il i t i e s o f wi l d t y p e o r d r u gr e s i s t a n t h e p a t i t i s B v i rus t o(一)一b e t a D一 2， 6一 d i a mi n o p u r i n e d i o x o l a n e a n d 2 一fl u o r o一5
16、一 me t h y b e t aL m b i n o f u r a n o s y l u r a c i l A n t i mi c r o b A g e n t s C h e mo t h e r ， 2 0 0 1 ， 4 5( 9) ： 2 4 9 52 5 01 2 L o e a r n i n i S Mo l e c u l a r v ir o l o g y a n d t h e d e v e l o p me n t o f r e s i s t a n t mu t a n t s ：i m p l i c a t i o n s f o r t h e r a p y S e mi n L i v e r D i s ， 2 0 0 5 ， 2 5 ( S u p p l 1
