用微通道分析仪(mc-fan)进行的血液凝结活化和微血栓形

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1、用微通道分析仪（用微通道分析仪（MC-FAN）进行的血液凝结活化和微血栓形成的实验室评价）进行的血液凝结活化和微血栓形成的实验室评价 摘要：迄今为止，全血中微血栓形成的实验室化验体系还未建立。微通道法可以通过血液流 动速率来评价在全血中微血栓的形成。在本研究中，我们以微通道分析仪（MC-FAN）作为 实验室化验体系，描述了血液凝结物活化和毛细血管堵塞的关系。经脂多糖（LPS）处理过 的全血流速对剂量和时间有依赖性并成下降关系。如果向全血中添加经 LPS 预处理过的单 核细胞（PBMC） ，血流速度将减慢。如果经抗组织因子（TF）预处理，抗体将阻碍由脂多 糖诱导而造成的血液流速下降， 这暗示着表

2、现在 PBMC 上的 TF 是造成微通道内血液流动速 度减慢的原因。一直的抗凝剂和抗血小板剂都会抑制由 LPS 造成全血流速变慢。血栓-抗血 栓联合体在 LPS-模拟全血中增加。如果在其中添加抗凝剂，血栓-抗血栓联合体减少，但对 抗血小板因子没有相关变化。 这些发现表明在微通道内的堵塞主要是因为由纤维蛋白网和血 小板凝聚组成的微血栓。而这些微血栓是由于 TF 在活性 PBMC 上的表现而形成的。另外， 我们同样发现 MC-FAN 对于毛细血管中的抗微血栓的实验室评价是非常有效的。 简介： 炎症是免疫系统对于由诸如细菌和病毒引起的微生物病原体感染而造成的细胞和组织 损伤的反应1。凝结的通道可以通

3、过这些微生物病原体进行活化，诱导在单核细胞上的组 织因子的表达2。TF 可以活化一系列的蛋白水解级联3，这致使凝血剂装转换为血栓。而 血栓又由纤维蛋白原中生成纤维蛋白。凝结的活化会促使凝结生成并降低纤维蛋白的消解， 这就导致在微血管中纤维蛋白凝结物的沉积， 进而可能造成组织血液不充分灌注并造成多组 织缺障（MOF）4。 剧烈炎症会首先诱导位于单核细胞上的 TF 表达，激活血液凝结。TF 在主体对病菌感 染的响应上起了很大的作用5。我们知道，微生物诱导细胞活性性是凝结系统的 TF 媒介活 性化的结果6，7。因此控制炎症响应将首要关联到增强血液的凝集性上8-10，而该病症 的多种关联病理反应是形成

4、异常血管内凝结和最终会导致器官缺障的血栓的首要原因11， 14。因此测量微血栓的形成可以为器官紊乱程度提供信息，并为我们找出治疗的方法。但 是，目前还不清楚，微血管内如何产生堵塞和血栓如何导致 MOF。另外，一般的血浆凝结 测试可以包括活化部分凝血酶时间测定（APTT） 、血浆凝血酶原时间测定（PT） 、血小板凝 集测定，这些测试可以不能得到器官内的微循环状况和其后的外源性脂多糖（LPS）或 TF 诱导血凝结活性。 在本研究中， 我们开发了一种新的临床化验系统， 这就是通过微通道分析仪 （MC-FAN） 来评价单核细胞活性对微血栓形成的影响。我们同样还利用 MC-FAN 检测了多种抗血栓剂 在

5、毛细血管堵塞上的效果， 并且发现该系统对于评价抗血栓和抗血小板剂在血栓紊乱上的效 果是非常有效的。 试验过程 材料 LPS（血清型 O26：B6）和 RPMI1640 培养基来自 Sigma（St. Louis,MO,USA） 。单聚分解 培养基来自于 Dainippon Pharmaceutical（Suita，Osaka，Japan） 。胎牛血清（FBS）购自 Gibco BRL，生命技术（Rockyville，MD，USA） 。单克隆 TF 抗体由 Chugai 制药提供（Gotenba， Shizuoka，Japan） 。Heparin 购自 Wako(Chuo-ku,Osaka,Ja

6、pan)。Hirudin 来自日本能源有限公 司（Toda，Saitama，Japan） 。Vlla 因子，活性蛋白 C（APC）和 TF 途径抑制物（TFPI）由 Chemo-Sera 协会提供（Okubo，Kumamoto，Japan） 。TNF和细胞重组可溶 TM（sTM）由 Asahi Chem （Fuji， Shizuoka， Japan） 提供。 抗血小板 GPb/a 拮抗剂 （FK633） 来自 Fujisawa 药业（Chuo-ku，Osaka，Japan） 。针对抗血栓化合物（TAT）和凝血素片段 1+2（F1+2）的 酶标记免疫附测定法（ELISA）套件 来自 Cedarl

7、ane（Hornby，Ontario，Canada） 。 使用 MC-FAN 测量血液流速的方法 图 1A 示意说明了 Kikuchi 利用 MC-FAN 的微通道法12原理。MC-FAN 通过测定流过硅晶 片上的微小液体通道的血流来分析微血栓的形成。 而这些微小液体通道是通过半导体精细加 工技术加工出来的（日立高科电子，东京，日本） 。图 1B 说明了晶片固定器的设置，其中 包括一块刻蚀着 8736 条 7m 宽（和微通道尺寸相近） 、30m 长的沟槽。刻蚀在单晶硅芯 片上的沟槽不会活化血细胞和血浆蛋白，在其上盖上光学平板玻璃就变成了密封的微通道。 在硅晶片固定器的入口连接着 100l 的样

8、品吸量管。这样，当连接到固定器出口处的带有 20cm 水的负压电磁阀开通时，样品就会流过微通道。所有实验使用经柠檬酸钠处理过的全 血。全血收集自健康志愿者的肘前横脉并以 3.8%的柠檬酸钠作为抗凝剂处理。此后，500 l 的全血样品将转移到吸量管中。 系统测定吸量管中样品通过硅晶片流路的时间， 共测定 100 l 样品， 以每 10l 样品显示。 同时全血流过硅晶片的过程会经过摄像机监控并记录在 PC 硬盘上。在每次测试血样前，系统都回测量 100l 磷酸盐缓冲溶液在常压下的通过时间， 并将其校正为 12s。流速通过每小时通过硅晶片的平均血样体积来测定。全血流速通过以下 公式计算： 血液流速（

9、l/s）=（10l/Tn）的平均值 Tn：每 10l 全血的通过实际，n=1 到 10。 扫描电镜 硅晶片用在 0.1M 磷酸盐缓冲溶液的 2.5%戊二醛进行清洗，pH 值为 7.4。硅晶片用磷酸盐缓 冲溶液清洗， 再用在 0.1M 磷酸盐缓冲溶液中的 1%OsO4 进行再冲洗。 这样残余的细胞脱水并 经临界点干燥，之后安上扫描电镜短轴并用 PtPd 包裹。在 JOEL JSM-T200 扫描电镜（东京， 日本）在 15kv 加速电压下成像之前，请将短棒保存在干燥的地方。 LPS-刺激全血的流速测定 用 10l 不同浓度 （0.16-20g/ml） 的 LPS 在 37下分别培养 1 毫升的全

10、血数个小时。 将 10l 的 PBS 添加到参比样品中，调解血球容积。此后立即将 40l 的 250mMCaCl2 添加 到经 LPS 处理的全血中，并用 MC-FAN 测定血液流速。 LPS-刺激 PBMC 在血液流速上的影响测定 根据生产商的说明，人体的 PBMC 可以通过单体聚合分解媒介（Mono-Poly resolving medium）进行分离。简单讲，将经柠檬酸盐处理的全血覆盖到单体聚合分解媒介上，并在 1500rpm 下离心分离 20 分钟。此后用 PBS 吸取 PBMC 馏分，并在含 10%PBS 的 RPMI1640 媒介 中悬浮。在 RPMI1640 种 PBMC 受不同

11、浓度的 LPS 或 TNF刺激 3 个小时。在培养以后，用细 胞刮收集 PBMC 并进行分离。将细胞球（5.0105 个）添加到 1ml 柠檬酸处理过的全血中并 进行重组，在添加氯化钙后就可以用 MC-FAN 测定全血流速了。 抗组织因子抗体，抗凝结，或抗血小板剂对 LPS-刺激全血的影响 为了测定抗组织因子（TF）抗体，抗凝结剂（heparin，hirudin，APC，sTM 和 TFPI） 以及抗血小板剂 （FK633 为 GPb/a 拮抗剂， 西洛他唑 （cilostazol） ， 扩冠嗪 （dilazep） ， 和盐酸沙格雷酯（Sarpogrelate） ）对 LPS（4g/ml）-刺

12、激全血的作用，样品先用 PBS（参 比）或对应的抗血栓剂处理 15 分钟，此后利用 MC-FAN 测定血液流速。为了分析抗组织因子 抗体，抗凝剂，或抗血小板剂对于 LPS-刺激全血流变性效果，将 1l 不同浓度的这些制剂 添加到 1ml 经 LPS 处理 3 小时的全血中，并在 37下培养 15 分钟。在实验中，最终添加剂 的浓度如下：抗 TF 抗体（1-200mg/ml） ，heparin 和 hirudin（0.01-1U/ml） ，和 APC，sTM， FK633， 西洛他唑 （cilostazol） ， 扩冠嗪 （dilazep） ， 和盐酸沙格雷酯 （Sarpogrelate）（0.

13、01-1 g/ml） 。 图 2 血液流经 MC-FAN 的图像。在添加了氯化钙的柠檬酸化全血中血液流经微通道 40 秒。 TAT 和 F1+2 的免疫测定 为了测定在全血样品中的 TAT 和 F1+2，将 500l 的全血样品等分放到单独的塑料试管中。 将 10l 的 LPS（200g/ml）添加到血样中进行培养。经刺激后，向每个样品中添加 5l 的抗凝剂和抗血小板剂并在 37下培养 5 分钟。在实验中添加的添加剂的浓度如上所述。 在经过培养之后，向每个试管中添加 20lCaCl2（250mM）并按照指定时间培养，此后向样 品中添加 20lEDTA 终止反应。为了去除细胞组分和凝结物，将血样

14、以 8000rpm 离心 5min。 收集剩余血清， 为了免疫在-20下进行保存。 血清样本中 TAT 和 F1+2 的 ELISA 根据制造商 手册进行操作。 数据 相关系数，变异系数和自身对照t检验（paired students t-test）用Stat ViewTM（SAS Institute，Cary，NC）的为Maxintosh开发的软件包行计算。 结果 LPS-激活全血的流速 我们利用MC-FAN来测定在LPS-激活全血中的微血栓的形成。 图.2显示在经LPS处理之前 （A） 和之后（B）的血样由硅晶片的上游流到下游的图片。扫描电镜图片（图.2C）显示，在微通 道中沉积的微血栓是

15、由包含红细胞、 白细胞和团聚的血小板组成的纤维网组成的。 通过硅晶 片的全血体积和时间间隔的定量关系如图.3A显示未经LPS处理的全血每通过时间的通过体 积几乎为恒量，而经过 LPS 处理的血液具有时间依赖性，并随时间增加而减少。图.3B 显示 的是根据在实验步骤中陈述过的处理过程，用 LPS 和未用 LPS 处理的血液流速。如图.4A 所 示，经柠檬酸在 37下培养 3h 后，未经 LPS 处理的全血流速没有显著的变化。但是经过六 个小时培养后流速下降。LPS 会致使血液流速随时间和浓度的增加而下降。为了测定在微血 栓形成过程中的活性单核细胞的作用， 我们用 LPS 或 TNA处理 PBMC

16、， 并将它添加到全血样 品中。其中添加了 PBMC 的全血对 LPS 浓度有依赖性，并成反相关。高浓度的 TNF（超过100U/ml）同样造成血液流速下降（未显示数据） 。 抗 TF 抗体和抗凝剂在 LPS 处理全血流速上的效果 添加抗 TF 抗体可以显著的削弱 LPS 刺激全血流动速度的下降程度 （Fig.5A） 。 当我们用浓度 大于 100ng/ml 的抗 TF 抗体处理血液后， 血流速度恢复到未经 LPS 刺激的状况。 添加强性抗 凝剂同样也可以防止 LPS 刺激全血的流速下降（图.5B-F） 。浓度高于 0.1U/ml 的 Heparin 可以显著改善血液流速的下降程度。 同样的， 添加浓度在 0.1U/ml 以上的 Hirudin 也可以改 善 LPS 刺激全血的流速的下降程度。 像血样中添加天然抗凝剂 APC （浓度在 0.1g/ml 以上） 同样可以恢复血液流速。重组 sTM 是凝血蛋白 C 活化的抗凝血余因子。它可以在浓度低