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1、讲座毛细管电泳的原理及应用* （ 第二讲） 毛细管电泳的原理及应用罗国安王义明（ 清华 大学生命科学与工程研究院 清华大学化学系 北京 1 0 0 0 8 4 ）1 概述毛细管电泳（ C E ） 除了比其它色谱分离分析方法具有效率更高、 速度更快、 样品和试剂耗量更少、应用面同样广泛等优点外， 其仪器结构也 比高效液 相色谱 H P L C ） 简单。 C E只需高压直流电源、 进样装置、 毛细管和检测器。前三个部件均易实现， 困难之处在于检测器。 特别是光学类检测器， 由于毛细管电泳溶质区带的超小体积的特性导致光程太短， 而且圆柱形毛细管作为光学表面也不够理想 ， 因此对 检测器灵敏度要求相
2、当高。 当然 在 C E中 也有有利于检测的因素， 如： 在H P L C中， 因稀释之故 ， 溶质到达检测器的浓度一般是其进样端原始浓度的 1% ， 但在C E中， 经优化实 验条件后， 可使溶质区 带到达检测器时的浓度和在进样端开始分离前的浓度相 同。而且C E中 还可采用堆积等技术使样品达到柱 上浓缩效果， 使初始进样体积浓缩为原体积的 1 / 1 0% ， 这对检测十分有利。因此从检测灵敏度的角度来说 ， H P L C具有良好的浓度灵敏度， 而 C E提供了很好的质量灵敏度。 总之， 检测仍是 C E中的关键问题， 有关研究报道很多， 发展也很快。 迄今为止， 除了原子吸收光谱、 电
3、感藕合等离子体发射光谱（ I C P 及红外光谱未用于C E外， 其它检测手段均已 用于C E 。 现将其归纳成紫外、 荧 光、 电 化学、 质谱、 激光类和其他类型检测器逐一作以介绍。2 紫外检测器和 H P L C类似， C E中应用最广泛的是紫外 可见检测器。 （ 1 类型： 按检测方式可分为固 定波长或可变波长检测器和二极管阵列或波长扫描检测器两类。前 一类检测器采用滤光片或光栅来选取所需检测波长， 优点在于结构简单， 灵敏度 比后一类检测器高；后一类检测器能提供时间- 波长- 吸光度的三维图 谱， 优点在于在线紫外光谱可用来定性、 鉴别未知物。有些商用仪器的二极管阵列检测器还可做到在
4、 线峰纯度检查， 即在分离过程中便可得知每 个峰含有几种物质； 缺点在于灵敏度比前一类略差。 采用快速扫描的光栅获取三维图谱方式时， 其扫描速度受到机械动作速度的限制。 用二极管阵列方式， 扫描速度受到计算机数据存贮容量大小的限制。由于C E的峰宽较窄， 理论上要求能对最窄的峰采集 2 0 个左右的数据， 因此要很好地选取扫描频率， 才能得到理想的结果。 （ 2增加灵敏度的方法： 由 于C E检测池的光路 长度即为毛细管的内径， 其一般不超过 1 0 0m ， 因 此， 细内径的毛细管柱限制了 紫外检测器的灵敏度。欲提高检测灵敏度 ， 可采用以下几种方法： 优化测定波 长： 用 C E分离 7
5、 种 青霉 素类药 物， 发现 在 1 8 5 n m下测定比在 2 1 4 n m下测定时的灵敏度大大 提高 多肽、 蛋白质等在 2 0 0 n m 以下测定也会大 大提高灵敏度。 而对H P L C ， 在 1 8 0 2 1 0 n m范围内 测定是很难实现的。实践中可通过测定不同波长下的信噪比来选择最佳测定波长， 以提高灵敏度； 减少检测噪音： 主要通过提高光源强度 ； 采用聚焦、 狭缝等减少背景光的影响； 采用电子和数字滤波， 设计良 好的信号放大系统。除了常用的氚灯和原子蒸气灯 （ 汞、 锌、 镉灯） 外， 还有一种“ 笔式线光源镉灯” （ p e n - r a y la m p
6、3 ， 可将光线聚焦到毛细管上， 对溶 菌 酶的 检测限可达 1 8 f m o l 1 0 - 5 m o l / L ， 线性范围为 4 个数量级 ； 扩展吸光光路长度： 可通过很多巧妙的设计来扩展光路长度， 如： 为了克服圆柱形毛细管表面引起散射、 失真等不利的光学特性及增加光路长度， 可用矩形或扁形毛细管， 如用5 0 1 0 0 m* 国家 自 然科学基金资助课题本文收稿日 期： 1 9 9 5 年3 月8 日截面的矩形管 ， 光路长度扩大 2 0 倍 ， 可使信噪 比增加 1 5 倍 ， 当然柱效也会有所下降 4 。也有采用泡型或 Z型特殊毛细管的， 如泡型毛细管可使光径从 5 0
7、m增至 5 0 0m ； Z型可使光径从 5 0m增至3 m m， 增加了近 6 0 倍 ， 可使信噪比提高至原来的 6倍， 但因体积增加将引起 2 0 %3 0 %的谱带扩张，导致柱效下降 5 。 此外， 特殊毛细管价格昂贵也是需考虑的。 对于普通毛细管， 有以下两种设计来增加光路长度： 轴向照射是将光束从毛细管末端沿管轴方向入射， 在毛细管侧面进行检测 6 。 一般用激光作光源， 荧光检测， 对 5 0 m 毛细管 ， 此法可使光路长度增为 2 m m， 灵敏度可增加近 5 0 倍， 但柱效损失 2 5% 0 %。另一种是多次反射池 7 ， 毛细管壁镀上银， 分别开入射窗和出射窗。 当入射
8、光以特定角度入射后， 将在毛细管 内反射 3 0 4 0 次后从出射窗 口射 出。 实测光程增加4 4 倍， 灵敏度可增加4 0 倍。（ 3间接测定： 间接测定可以解决许多直接检测所不能解决的问题， 还提供了“ 统一标准” ， 即所有组 分浓度可从一条标准曲线算得。紫外间接测定采用在缓冲液中加入有紫外吸收的添加剂的方法， 溶质因无紫外吸收而产生倒峰， 主要用于离子分析 。3 荧光检测器荧光检测器是 C E所用的第二大类 已商品化的检测器， 和紫外（ U V 检测器相比， 检测限可降低 3 个数量级 ， 是一类高灵敏度和高选择性的检测器。已用于痕量分析和脱氧核糖核酸（ D N A） 序列分析，
9、大大拓宽了C E的应用范围， 具有广泛的应用前景。（ 1普通荧光检测器 ： 采用氚灯 （ 低波 长 UV区） 、 氙弧灯（ U V到可见光区） 和钨灯（ 可见光区） 作为激发光源， 即为普通荧光检测器。 对荧光黄检测限可达 2 n g / m L ， 这个结果和用氚灯测定 2 4 0 n m 下的吸光度相比， 只是后者的 1 。（ 2 ） 激光诱导荧光检测器（ L I F ： 激光的高光流量、 聚光性、 单色性等特点使其成为理想的激励源。常 用 氦- 镉 激 光 器 （ 3 2 5 n m） 和 氩 离 子 激 光 器 （ 4 8 8 n m 。对荧光黄最低检测限为 1 0 -m o l /
10、L ， 约 6 0 0 0 0 个分子或更低 。 有关L I F的 应用可参见 最新文献 1。（ 3其它： 许多药物和一些多肽有天然荧光。对没有荧光的溶质， 需将其衍生化 ， 有柱前衍生和柱后衍生两种方式； 也可采用间接测定能量转移检测 2 ， 而无需衍生化； 还 可采用包层流池 （ s h e a t h -f lo w c u v e t t e ） 来解决激光在毛细管上产生的散射， 对异硫氰酸荧光素 F I T C ） 衍生精氨酸检测可达 1 . 71 0 -m o l 1 . 3 1 0 - 1 2 m o l / L 13 。 还出现荧光二 极 管阵列检测 器 4和 L I F 电荷
11、藕合器件 （ C C D） 系统 1 ， 对 F I T C衍生氨基酸的检测限为 2 1 0 - 2 0 m o l （ 约 1 0 - 12 m o l / L。 最新的 动向 是采用价格低廉的半 导体 激光器作激励源 16 ， 激发波长在 6 3 5 8 5 0 n m，用于可见和近红外区， 检测限可达 f m o l 级。 4 质谱检测器 将现今最有力的分离手段 C E和能提供组分结构信息的质谱（ MS 联用， 是分析工作者追求的 目 标。由 于C E流动相体积小， 因此， 较之H P L C 更易实现与 MS的连接。目 前已有商品C E / MS系统， 提 供了一种分离和鉴定相结合的强
12、有力的技术。 C E / MS在线联用， 接 口系统是其“ 脏” ， 既要保持 C E的高效性， 又要满足 MS仪器的要求， 通常需考虑样品离子化技术和 C E / MS接 口的设计。虽然有多种离子化技术可用于 MS ， 但用于C E / MS的仅有快原子轰击（ F A B ） 和常压离子化（ A P I ， 其中又可分为电 喷雾E S I 和离子喷雾I S P ） 两种。 接口 设计有同 轴接口和液体连接接 口， 最常用的是如下两类：（ 1同轴连续流快原子轰击接口： 用一 T形接 头将C E 柱嵌入能注入基质溶液的另一内 径较大的 毛细管中， 再固定在不锈钢探针轴末端， 同轴的两根毛细管与样
13、品靶连接。用一束快速移动的原子束或离子 束轰击样 品靶， 即可产生离子流， 获得质谱 峰 17 。 （ 2电喷雾电离接口： C E毛细管柱流出的样品 溶液在几千伏 电压作用下， 表面带电产生库仑排斥力， 使液滴成雾状喷出。 引入离子源中的热氮气流使雾状液滴蒸发， 形成离子流， 经聚焦进入质谱仪 8。 C E / MS 在肽链序列 及蛋白 结构、 分子量测定等 方面 1 9 有卓越的表现 ， 许多方面的研究正在开展，可以预见这是最有发展前途的技术之一。5 电化学检测器 电化学检测器（ E C ） 可避免 C E中光学类检测器遇到的光程太短的问题 E C和 L I F同为 C E中灵敏度最高的检测
14、器， 其缺点在于商品化较难， 至今没有商品电化学检测器供应。（ 1电导检测器： 柱上电导检测是在毛细管壁上用激光钻两个孔 ， 插上两根铂电极， 再将孔封住即 成。其检测限 以 L i+ 计可达 1 0 - 7 m o l / L 1 0 - 18 m o l 2 0 。 柱尾检测则在分离毛细管后再接上电导检测器。还有的是将柱尾电导检测器和安培检测器组合成一个检测器进行测定 1。（ 2安培检测器： C E中微量样品可使库仑效率 大大 提高， 在H P L C中 此值很少超过1 0 ， 而在C E 中可 达 4 0 % 以上。 Wa l lin g f o r d 等2 2 用2 cm碳纤维 超微
15、电 极插在 9 m内 径毛细管中 组成安培检测器， 对 5 - 羟色胺的检测限为 0 . 7 a m o l1 0 - 8 m o l / L ， 并可用于单个神经细胞内组分的分析。采用 34 - 二羟基苯甲胺（ D H B A） 作添加剂也可实现电化学间接测 定， 对精氨酸 检测限为3 8 0 a m o l1 0 - 7 m o l/ L 23 。 6 激光类检测器采用激光作激励源的除 L I F外 ， 还有多种模式。物质受到光子幅射后产生与之相关的温度场， 引起密度、 折射指数、 应力等各种光、 热及机械性能的变化（ 称光热效应） ， 对这些参数进行测定可获得有关物质的组成或结构的信息，
16、 称为光热光谱。激光照到毛细管后， 导致管内样品受热、 温度升高， 而不同的温度形成了折射指数的梯度分布， 类似一光学透镜， 使另一束探测激光产生散焦或偏转， 测定此散焦或偏转就可以进行定量分析 ， 此为激光热透镜检测。对 1 8 种丹磺酰氨基酸检测限为 1 0 - 1 8m o l 2 4 。 激光照射到毛细管产生的光热效应诱导毛细管局部热膨胀， 发生弹性振动， 振幅正 比于样品的吸收 ， 并能使另一探测激光产生偏转， 此为激光诱导毛 细管振动检测。 对核黄素检测限为8 0 a m o l ， 比U V检测降低了三个数量级 2 5 激光光热检测限与光程无关， 适用于 p L级痕量分析， 但不具备选择性。用激光束聚焦到毛细管上， 产生的散射光由一束围绕着毛细管的光纤引导到拉曼光谱仪的接收器上， 即构成了激光拉曼检测器， 检测限以甲基红计 ， 为2 . 5 1 0 - 6 m o l / L 2 6 ， 与U V检 测器相当。 也可采用 C C D
