血管紧张素ⅱ促进树突状细胞成熟和功能

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1、http:/ - 1 - 血管紧张素促进树突状细胞成熟和功能血管紧张素促进树突状细胞成熟和功能1 杨红振，刘含智，米粟，花芳，胡卓伟* 中国医学科学院 Walkersville, MD)检测，结果表明 Ang II 溶液中同位素素水平0.01ng/ml。 2.2 细胞培养细胞培养 小鼠DC前体细胞购自美国ATCC公司(CRL-11904)，培养于补加20%胎牛血清(FBS, BIoWhittaker, MD)、1 mM 丙酮酸钠、0.1 mM非必需氨基酸、 100 U/ml 青霉素和链霉素、5ng/ml重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的-MEM培养基中 6。为评价AngII

2、对DC前体细胞表型的调节作用，以5105 细胞/ml密度氢把DC前体细胞接于6孔板中，然后加入不同剂量的Ang II（如图所示）刺激；于37C、5%CO2条件下培养，24小时后收集细胞，进行检测。 2.3 流式细胞术流式细胞术 参考文献 7,8，收集细胞，PBS 洗两次后，加入 1% BSA/PBS 封闭 40min；加入 0.5ml左右 PBS， 1500rpm 离心 5 分钟， 弃上清； 加入 2-3 种适量 FITC、 PE 或 PE-cy5 标记的 CD11c、MHCII、CD40、CD80、CD86、CD54、OX40L 抗体，避光孵育 1 小时；PBS 洗两次；加入500ul 固定

3、液固定细胞；200 目筛网过滤后流式细胞仪检测。 2.4 细胞内流式细胞术细胞内流式细胞术 DC 与幼稚型 T 细胞混合培养 3 天后，加入 50 ng/ml PMA 和 1mol/L Ionomycin 刺激 6小时，以刺激大量 IFN-和 IL-4 产生 9。在结束前 4 小时加入 1.7g/ml Monesin，以阻止细胞因子分泌。收集细胞，流式洗液洗细胞 3 次后，用 PE-cy5 标记的 CD4 抗体染色 45 分钟；流式固定液固定 10 分钟后洗净细胞；0.5%皂素溶液透膜后，分别用 FITC 链接的 IL-4 抗体和 PE 链接的 IFN-抗体标记细胞。 用 CD4 设门， 流式

4、细胞术分别检测 AngII 对 IFN-和 IL-4的调节作用 10。 2.5 混合淋巴细胞反应混合淋巴细胞反应 参考文献 11获得纯化T细胞。无菌取出BALB/c 小鼠脾脏，磨碎、经150目筛网过滤，获得单细胞悬液。把单细胞悬液加入已润湿的尼龙毛柱中，37 C孵育5060分钟，过滤获得纯化T细胞。经流式细胞术检测，T细胞的纯率大于90%。收集经不同处理的DC细胞，用丝裂霉素C（50g/ml）处理30分钟，PBS洗三遍；按照效应细胞（E，DC细胞）和靶细胞（T，T细胞）比例1:10、1:30和1:100分别混合DC细胞和T细胞。混合后继续培养3天，收集细胞，用细胞内流式细胞术检测CD4+IFN

5、-+ TH1细胞和CD4+IL-4+ TH2细胞。 http:/ - 3 - 2.6 Western Blot 取适量培养细胞或组织匀浆液，加入裂解缓冲液 (含有 1%NP-40、0.5%脱氧胆酸钠、0.1% SDS 以及 1(mol/L 的 Aprotinin、Trypsin inhibitor、PMSF、Leupeptins 和 DTT)，振荡混匀，冰上放置 30min，间或振荡；4C、12000 rpm，离心 15min。取上清，Branfold 法测定蛋白浓度，调节蛋白浓度至相同，分装，一部分用于 SDS 电泳，其余部分置于80C 保存；ECL 和 ECL-Plus 显色系统(Amer

6、sham Biosciences)显色。Western-blot 印迹分析软件(Gel-pro 3.2)，测出各条带的光密度值，分析多种蛋白质，包括 Actin、ERK 和磷酸化 ERK等表达情况。 2.7 统计分析统计分析 实验结果用均值标准误(XSE )表示，经参数或者非参数方差检验，经比较 p0.05认为有统计学差异，p0.01 认为较显著的统计学差异。 3. 结果结果 3.1 AngII上调上调DC前体细胞表面分子表达，促进前体细胞表面分子表达，促进DC成熟和功能成熟和功能 为探讨AngII对DC细胞成熟的调节作用，我们利用流式细胞术分别检测AngII处理后DC细胞成熟相关表面分子CD

7、11、MHCII、CD40、CD80、CD86、CD54和OX40L的表达。我们的结果表明， AngII剂量信赖式上调DC细胞表面标志分子CD11c表达。 当AngII浓度分别为10、100和1000 nmol/L时，CD11c+细胞百分率由23.2 + 1.62%分别上调至37.7 + 1.12%、43.4 + 3.62% 和80.0 + 4.35%（图1A） 。MHCII在DC成熟和抗原呈递过程中发挥重要作用，为获得性免疫提供第I信号。Ang II刺激显著诱导MHCII表达。当AngII浓度分别为1、10、100和1000 nmol/L时，MHCII +DC的百分率分别由10.2 + 1.

8、21%增加至54.4 + 4.38%、85.3 + 7.63%、96.2 + 5.66%和98.6 + 6.48（图1B） 。CD40、CD80、CD86、CD54和OX40L均是重要的辅助刺激分子，为获得性免疫反应提供第II信号。Ang II可显著增加DC细胞CD40（图1C） 、CD86（图1E）和OX40L（图1G）表达，抑制CD80（图1D）和CD54（图1F）表达。其中Ang II对CD40和CD86表达的上调作用和对CD54表达的抑制作用呈剂量依赖式。 http:/ - 4 - MHC II+ DCs (%)0204060801001200 1 10 100 1000 Concen

9、tration of Ang II (nmol/L)CD11c+ DCs (%)0204060801000 1 10 100 1000 Concentration of Ang II (nmol/L)CD40+ DCs (%)051015202530350 1 10 100 1000 Concentration of Ang II (nmol/L)CD80+ DCs (%)012345670 1 10 100 1000 Concentration of Ang II (nmol/L)CD86+ DCs (%)010203040500 1 10 100 1000Concentration of

10、Ang II (nmol/L)OX40L+ DCs (%)010203040500 1 10 100 1000 Concentration of Ang II (nmol/L)CD54+ DCs (%)0510152025300 1 10 100 1000 Concentration of Ang II (nmol/L)ABCDEFG图 1 Ang II 促进 DC 成熟。用不同浓度 AngII（0、1、10、100 和 1000 nmol/L）刺激 DC 前体细胞。培养24 小时后收集细胞、染色，流式细胞术分析 DC 细胞表面分子：CD11c (A)、MHC II (B)、CD40 (C)、

11、CD80 (D)、CD86 (E)、CD54（F）和 OX40L。结果以三次独立实验阳性百分率的平均值 标准差（SD）表示。 3.2 Ang II处理处理DC诱导诱导TH1/TH2免疫平衡向免疫平衡向TH2方向漂移方向漂移 为检测 Ang II 诱导成熟的 DC 功能， 我们进行了 DC 与幼稚型 T 细胞的异源混合淋巴细胞反应实验。当效应细胞（E，DC 细胞）与靶细胞（T，幼稚型 T 细胞）的比例（E:T）分别为1:10 和1:30 时， Ang II可显著抑制 DC 细胞诱导CD4+T 细胞产生 IFN-的能力 （P0.01）（图 2C 和 E） ； 当 E:T 为 1:100 时， An

12、g II 处理的 DC 对 CD4+T 产生 IFN- 的能力没有显著调节作用 （图 2A） 。 Ang II 受体 1 （AT1） 的阻断剂洛沙坦可显著逆转 Ang II 处理 DC 对 CD4+T细胞产生 IFN- 的抑制作用（图 2A、C 和 E） 。 另外，当 E:T 为 1:100、1:30 和 1:10 时，Ang II 处理的 DC 均可增加 CD4+T 细胞产生 IL-4 的水平。 当 E:T 为 1:100 时， 100nmol/L Ang II 处理的 DC 可诱导 IL-4 产生 CD4+T 细胞百分率分别由 11.2 + 1.33%增加为 19.6 + 2.35% （P

13、0.01） （图 2B） 、由 23.8 + 0.45%增加为 34.1 +0.45%（P0.01） （图 2D） 、由 32.4 + 0.95%增加为 41.9 + 2.95%（P0.05） （图 2F） 。洛沙坦可显著抑制 Ang II 促进 DC 细胞诱导 T 细胞http:/ - 5 - 产生 IL-4 的能力；当 E:T 为 1:100、1:30 和 1:10 时，洛沙坦可将 Ang II 处理 DC 诱导 IL-4产生 CD4+T 细胞百分率下调为 13.2 + 1.20%（P0.01） （图 2B） 、25.5 + 0.35%（P0.05） （图2D）和 39.6 + 0.00%

14、（P0.05） （图 2F） 。 IFN-+ T Cell (%)010203040E:T=1:100IL-4+ T Cell (%)0510152025E:T=1:100IFN-+ T Cell (%)0102030405060E:T=1:30IL-4+ T Cell (%)01020304050E:T=1:30IFN-+ T Cell (%)0102030405060UntreatedLPSAng II LosartanAng II+LosartanE:T=1:10IL-4+ T Cell (%)01020304050UntreatedLPSAng II LosartanAng II+Lo

15、sartanE:T=1:10ABCDEF*#* #*#* *#*#*图 2 Ang II 处理 DC 诱导 T 细胞增殖，促进 IFN- 和 IL-4 产生。AngII (100nM)刺激 24 小时后，用 50g/ml的丝裂霉素 C 处理 DC 30 分钟。PBS 洗三遍后与同源 T 细胞混合效应细胞（DC，E）与靶细胞（T 细胞，T）的比例（ET）分别为 1:10, 1:30 和 1:100培养 3 天。流式细胞术检测 IFN-（A，ET=1；00C，ET=1；03E，ET=1）01和 IL-4（B，ET=1；001D，ET=1；03F，ET=1）01产生。图中所示为三次独立实验结果，以阳性百分率的平均值 标准差（SD）表示。*P 0.05, *P 0.01, *P 0.001 vs 对照组; #P 0.05, #P 0.01, #P 0.001 vs Ang II 处理组. 3.3 Ang II刺激刺激ERK磷酸化磷酸化 为进一步探讨 Ang II 诱导 DC 成熟和功能的细胞内信号机制，我们主要检测了 Ang II对 ERK 表达和磷酸化活性的调节作用。用 100nmol/L 的 Ang II 刺激 DC，可时间依赖性促进 ERK 的磷酸化活性：Ang I