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1、!“ 卷 # 期 !$% 年 ;(0- C067- +6 ?-27()(C9 1-602 674 F-,-)(;.-7376（ “I#“”G0(C06.-） （+(*!$!:!(7437C 68(- D(28 (D A69 A-0- 6;0(,-4 -7 EH 37D-232 EHC-7- （）A6 4- 2(00-;(7437C - EH C-7-* J-34-， 4-.(76- EH C-7- 6,- D(0.-4 - (- 62- - 62- 2(7 6? 感染机制研究和抗病毒药物筛选提供了细胞模型。)材料和方法)*)细胞系 中国仓鼠卵巢癌细胞系 6V=I 由武汉大学中国典型培养物保藏中
2、心 （66R66） 提供。6V=I 细胞系于含 UWCSE 的 ;JCA 培养基中常规培养并传代。)*+真核表达质粒的构建 真核表达质粒 5+;DGOX （ Y ）（含 “$, 筛选标记） 由本室保存。以含有 6? 全长基因组的质粒6?=Z:为模板， 针对 6? 的 U 个功能基因序列分别合成 U 对引物 （表 ） ， 在上游引物 （C6? 功 能基因的细胞系： 分别将含有 6? 单个基因的5+;DGOX （ Y ） 质粒线形化， 线性化使用的限制性内 切酶见表 ， 按照 Q!5,1$+DGOX （ Y ） =3,+7（!“#线形化） 作为对照。转染后的细胞在含有PN 的培养基中筛选并传代，
3、最终形成具有 PN 抗性的稳定传代细胞系。)*0稳定表达细胞系中 -./ 单基因的鉴定 胰酶消化贴壁生长的 6V=I 细胞， 用含蛋白酶 I 和 LD(%$G 的细胞裂解液 （U33,2JQ R*!%=62，FU33,2JQ D(62， U33,2JQ K;RG， UXNW E;E） 重悬细 胞， FT水浴过夜后酚J氯仿抽提除去蛋白， 上清用乙醇沉淀后得到细胞的总 ;DG。分别以 U 株稳定表达细胞系的总 ;DG 为模板， 用相应基因的克隆引物 C6? 基因。)*1稳定表达细胞系中 -./ 基因转录 2345 检测6V=I 细胞中总 LDG 的提取按 R*!,2 试剂盒 （B“#!D(%$#于
4、O水浴处理 AU3!“， 以去除 ;DG 的干扰。以总LDG 为模板， 分别以相应基因的克隆引物 L ） ?%+$AB;C4： AD?E:EFFE:FE:E:F:?;D （!“#0!） G4： AD?EEE:FFFF:EEEE:EFEEE:FEE?;D （$% ） ?6=ABI6=C4： AD?EE:FFE:FEF:EFEE:EEF?;D （*+,G“） 6=G4： AD?EEFE:EFF:EF:EEE:E?;D （-.,“）/+%“*59!:; ） ?6J=KLM6JC4： AD?EE:EFFE:FEEEE:EFE:EEEE?;D （!“#0!） 6JG4： AD?EEE:FFF:EEF:E
5、FFEEEF:F?;D （$% ） ?*B=LM*BC4： AD?EE:EFFE:FEEFFEE:E:FEEFEEF?;D （!“#0!） *BG4： AD?EEE:FFF:EEEF:EEFEEEE?;D （$% ） ?!NJIA=!NJC4： AD?EE:FFE:FEE:EEE:E:FEEFE?;D （*+,G“） !NJG4： AD?EEFE:EFF:EE:EFE:FE?;D （-.,“）()“*59!:; ） ?!N;=LM;!N;C4： AD?E:EFFE:FEEE:F:EEF:?;D （!“#0!） !N;G4： AD?EEE:FFF:EFE:E:FF:EEF:E?;D （$% ）
6、?!NO:=IJO:C4： AD?E:EFFE:FE:E:FFEEEFEFEE?;D （!“#0!） O:G4： AD?EEE:FFF:E:FFF:FFF:FE?;D （$% ） ?!NOPBL;OPC4： AD?E:EFFE:FEEFE:FFF:?;D （!“#0!） OPG4： AD?EEE:FFF:E:FEEEFEE:E:EFF?;D （$% ） ?!NA:=;O=A:C4： AD?E:EFFE:FEFEEFEFEEF:E?;D （!“#0!） A:G4： AD?EEFE:EFF:E:E:E:E:EFFE?;D （-.,“）()“*59!:; ） ?!NAP=BB;APC4： AD?E:
7、EFFE:FEFE:FEFF:FE?;D （!“#0!） APG4： AD?EEE:FFF:FEEFFEEEE:E:EEF:E?;D （$%*!Y94?E/55%,$I?!P9?E/5$+ （ Y94） 经过计数的细胞溶解在 =K#%/Z1 F+-,?H/ 缓冲液（*H B结果7!含有 “#$ 功能基因真核表达质粒的鉴定图 =HR 单基因真核表达质粒的双酶切鉴定C-2U=W0$.- ） ?%+$，AB;3*；J：*59!:; ） ?6=，ABI3*；;：*59!:; ） ?6J，=KLM3*；O：*59!: ; ） ?*B，=LM3*；A：*59!:; ） ?!NJ，IA=3*；I：*59!:
8、; ） ?!N;，=LM;3*；B：*59!:; ） ?O:，=IJ3*；L：*59!: ; ） ?OP，BL;3*；M：*59!:; ） ?A:，=;O=3*；=K：*59!:; ） ?AP， =BB;3*U根据表 = 中 =K 个不同基因上游和下游引物上 的酶切位点， 分别对相应的重组质粒进行双酶切鉴定， 电泳结果显示 （图 =） ， HR 的 %+$、 6=、 6J、 *B、!NJ、 !N;、 !NO:、 !NOP、 !NA: 和 !NAP 基因都分别成 功地克隆到 *59!:; ） 中， 双酶切得到的片段大BMM郭佳等：丙型肝炎病毒功能基因在 H 细胞中的表达研究小与病毒基因的大小相符
9、。测序结果显示， 所克隆的 !“ 个质粒中 #$% 基因的序列没有发生缺失、 替换和移码突变 （7、 $#./0!/:;、 $#./0!/:;?=、 $#./0!/:;?， 12!3 筛选浓度为 “!ABCD。!“? 蛋白， 且蛋白质分子量与文献报道相 符!“（图 84*(5I) （ Y 3U?J G,5 8+A5 )ZCN54 845+5)(+ ( (,5(*8， (,5 C*O5KZO4 -5IA,( ( (,5 O5L(J3RR!“#$%&% ()*$+, (- .#(/%0“$(,(12生物工程学报7“9， %*OV7$?与宿主相互作用的研究一直以来进展缓 慢， 原因是缺乏有效的支撑
10、$? 增殖的体外培养体系， 各国学者在这方面作出了很多探索， 也取得的一些进展 A B。本研究通过构建含有 $? 功能基因的真核表达质粒， 在 #!C 的筛选压力下建立了稳定表达 $? 功能蛋白的稳定细胞系， 为研究 $? 功能基因与特殊宿主细胞因子相互作用的关系提供了便利的平台。为了鉴定外源的 $? 基因是否已经整合到细胞的基因组上， 我们分别于培养的不同代次检测了细胞内相应的 $? 基因的 )DE， 结果表明相应的基因已经整合到宿主基因组上。为了证实整合的基因是否能在宿主细胞内正常转录并表达， 我们检测了稳定传代细胞内相应的 $? 基因的 :FDE， 结果表明所有的 $? 基因都得到了转录
11、。由于缺乏所有的 $? 单个蛋白的抗体， 我们只检测了 $GHIHJ， $GHIHJK 和 $GHIHDLBM 三株细胞系中 J、JK和 DLBM 蛋白的表达， 检测的结果也显示， $? 的蛋白在宿主细胞中已经形成稳定的表达。同时，经过冻存并复苏的细胞仍能检测到其相应的 )DE、:FDE以及蛋白的表达， 说明冻存和复苏并不会造 成外源基因的丢失。可见， 我们已经获得 N 株含有$? 单个功能基因的稳定传代细胞系。 为了探讨 $? 功能基因表达对宿主细胞脂质代谢的影响， 我们检测了所有稳定表达细胞系中， 脂质代谢途径中 “)OH葡萄糖神经酰胺葡萄糖基转移酶的酶活性。已有研究表明， $? 感染与宿
12、主脂代谢密切相关。实验结果显示， 所有整合有病毒基因的细胞系中 “#$# 的酶活性均高于对照细胞系， 尤其是 $GHIHJK 和 $GHIH=P 两株细胞系。说明病毒基因的表达能提高细胞内的 “#$# 酶活， 从某种意义上说， 活跃了细胞的脂质代谢。这与感染$? 的黑猩猩体内 “#$# 的表达量与 $? FDE 水 平呈正相关!的结果是一致的。鉴于以上的结果，“#$# 酶活的提高有两种可能， 一是底物的积累， 二 是 “#$# 蛋白本身的表达被上调了， 究竟是哪种机制还需要深入的研究， 但是初步的研究已经把起主要作用的病毒基因锁定在 JK、 =P、 DLK 和 DLBE 上了， 具体病毒基因表
13、达和细胞脂代谢之间是直接作用还是间接作用还需要进一步的实验验证。“#$#“#%&# （参考文献） O-3.19$?&./*,+&-.( %!&“ (#)“*)! +!& ,$*- .#&“(/!-“!(/$， KNNN， ()： K A KKC( K M19+*.4,061*9 F， S-0:1. ?( F*=6&,1+&-. -/ 0*=1+&+&4 $ 2&984( 0.!- 1*(/$， KNNN， *(：TU A T!C( U O1.+*21 7， I-9V131 ， W1:*6 L( *=1+&+&4 2&984*4 1.*=1+&+&4 $ 2&984 FDE 9*=6&,1+&-. &49*861+*&9-40& L，I-&,0& G，71410&9- E，!“ #$(-4+ 4=0&.-6&=&195-9S15-91+-93 O9*44， ZCZ， =(BU A BNC( Z L0&.&,0& X， &41V- L， #*. L， !“ #$( J=9*44&-. ,6-.&. -/ 1 ,)DE /-908:1.,*91:&8+,0&.4-. 4+91&. ）&. ,86+89*， L1+-98 L， W-.1+01. E， !“ #$( E. *- =*“(/ :-G 细胞中的表达研究
