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1、 1南京军区军事医学研究所 南京 210002 第一作者: 男, 36岁, 博士, 副研究员乙型肝炎表面抗原 124aa 分子在大肠杆菌中的 高效表达房德兴1 李法卿1 谭维国1 陈华标1 金慧英1 李素芹1摘 要 利用聚合酶链反应特异性扩增编码乙型肝炎表面抗原(HBsAg)羧基末端 124 个氨基酸的基因片段, 并将其在大肠杆菌中获得了高效表达。表达产物氨基末端有 1 个含 6 组氨酸肽段的 20 氨基酸融合部分, 分子量 16178Da, 以包含体形式存在, 约占细菌总蛋白的 22% 。以 HiTrap 亲和层析纯化, 纯度可达 95% 以上。分别用抗 HBsAg多克隆抗体和抗HBsAg
2、a单克隆抗体进行ELISA检测表明, 该蛋白具有HBsAg反应原性。 关键词 乙型肝炎病毒 乙型肝炎表面抗原 大肠杆菌 基因表达 中图号 R392. 1EXPRESSIONOFTHEHEPAT IT ISB SURFACEANT IGEN FRAGMENT WITH 124 AMINO ACIDS IN E.coliFang Dex ing, Li Faqing, T an Weiguo, Chen Huabiao, Jin H uiying, Li Suqin ( H uadong Research Institute of Medical Biotechnics, Nanjing 2100
3、02)Abstract T he gene fragment coding the124amino acids of the carboxyl terminus of hepatitis B surface anti- gen(HBsAg)was amplified by polymerase chain reaction(PCR) and the shorted HBsAg was expressed in E. coli in a fusion protein fashion. The fusion protein was 16178Da in molecular weight and c
4、ontained a 20-amino- acid fusion portion at its amino terminus which contained a six- histidine peptide segment. The expressed proteins aggregated into inclusion bodies weigh about 22% of the total bacteria proteins. It was easily purified with the HiT rap affinity matrix with a purity up to 95% . E
5、LISA detection showed that the protein could be recognized by polyclonal anti- bodies against HBsAg and monoclonal antibody against HBsAg a determinant.Key words Hepatitis B virus,Hepatitis B surface antigen,E.coli,Gene expression在当前和今后相当长的一段时间内, 疫苗注射 仍是预防、 控制乙型肝炎的最主要手段之一。 随着血 源疫苗的逐渐被淘汰, 基因工程将是获得乙型肝
6、炎 疫苗的唯一途径。由于乙型肝炎表面抗原( HBsAg) 本身的结构特点, 在早期的研究中, 人们发现原核系 统( 大肠杆菌) 表达的蛋白没有活性( 抗原性) , 因此 将注意力转到真核表达系统中 1。 在 HBsAg 真核表 达方面, 国内外已做了大量工作, 除了酵母菌外, 还 使用过各种各样的哺乳细胞, 如 3T 3 细胞、 非洲绿 猴肾细胞、 中国地鼠卵巢细胞等。 虽然目前已经开始 推广使用基因工程乙型肝炎疫苗, 但众所周知, 真核 系统途径的表达量远远难以满足巨大的市场需求; 同时所采用的传代细胞系也存在诸多弊端。有高效 表达水平的原核系统用于乙型肝炎疫苗生产的潜力 和吸引力始终存在。
7、 在分析已知乙型肝炎病毒( HBV) 基因组结构的基础上, 本研究扩增了编码主要中和性 a 抗原决 定簇的HBsAg 羧基末端124 个氨基酸的基因片段, 并在大肠杆菌中获得了高效表达。利用抗 HBsAg a 抗原决定簇单克隆抗体( McAb) 和抗 HBsAg 多克 隆抗体( PcAb) 初步检测表明: 这种截短的 HBsAg 分子具有抗原活性。1 材料与方法1. 1 主要材料 菌种 E. coli T G1, 质粒 pUC18, 中国科学院上 海生物化学研究所甘人宝研究员惠赠; 菌种 E. coli BL21( DE3) , 质粒 pET -28a( + ) 由本研究所朱敏生 博士惠赠。
8、各种限制性内切酶( Promega 公司或华美 生物工程公司) ; T 4DNA 连接酶、 T ag DNA 聚合酶 ( Promega 公 司) ; 异 丙 基-? -D-硫 代 半 乳 糖 苷 ( IPTG, Promega 公司) ; HiT rap 凝胶( Pharmacia 公180免 疫 学 杂 志 第 15 卷 第 3 期 1999年 7月 IMMUNOLOGICAL JOURNALVol15No3July1999司) ; 抗a McAb S17( 卫生部上海生物制品研究所) ; HBsAg ELISA 试剂盒( 本所产品) ; PCGENE 计算 机软件( Release 6.
9、 70, IntelliGenetics 公司) 。 1. 2 引物设计与 DNA 扩增 利用 PCGENE 计算 机软件, 分析已知的 HBV 基因组序列, 结合国内克 隆的 HBsAg 编码区 2序列设计、 合成寡核苷酸引 物, 进行常规聚合酶链反应( PCR) 扩增。*这里列出了 48 个 HBV 全基因组序列( 其它若干 S 基因部分序列没有被引用) , 它们的基因名称为: HBHEPB, HEHBVAYR, HBU46935, HBVADR, HBVADR4, HBVADW, HBVADW2, HBV ADW4A, HBVAYWC, HBVAYWCI, HBVAYWE, HBVAYW
10、GEN, HBVAYWMCG, HBVB5HK01, HBVCGWITY, HBVDNA , HBVP2CSX, HBVP3CSX, HBVP4CSX, HBVP4PCXX, HBVP5PCXX, HBVP6CSX, HBVP6PCXX, HBVXCPS,HPBA11A,HPBA1HKK2,HPBA2HMS2,HPBA2HYS2,HPBADR1CG,HPBADRA,HPBADRC,HPBADRM,HPBADW1,HP- BADW2, HPBADW3,HPBADWZ, HPBADWZCG, HPBAYW, HPBB4HST 1, HPBC4HST 2,HPBC5HK02, HPBC6T 588,
11、 HPBCG, HPBCGADR, HPBHBV AA,HPBM UT,HPBVCG,ZZHEPAV1. 3 基因克隆与表达质粒的构建 按常规方法进 行, 所涉及的质粒 DNA 抽提、 限制性酶切、 DNA 连 接和细菌转化等均参考文献 3 。 1. 4 SDS- PAGE 分析 按参考文献 3 进行 SDS- PAGE 分析, 采用 5% 浓缩胶、 15%分离胶。经考马 斯亮蓝 R250 染色后以密度扫描仪确定目标蛋白占 细菌总蛋白的百分比。 1. 5 表达产物的纯化 按 HiT rap 凝胶层析试剂 盒操作程序进行融合蛋白的纯化。 1. 6 表达产物的抗原性检测 采用常规 ELISA 夹
12、心法进行, 分别使用抗 HBsAg a McAb 和抗HBsAg PcAb 作为包被抗体。2 结果2. 1 引物设计与 PCR 扩增 分析下载自美国国家 生物技术信息中心( http: www. ncbi. nlm. nih. gov) 的 48 个 HBV 基因组序列*, 发现在 preS/ S 基 因区内除了已知的 preS1、 preS2 和 S 区的起始密码 外, 同一开放阅读框架( ORF) 内、 HBsAg 主要中和 性 a 抗原决定簇编码区前还有另外 2 个完全保守的 AT G。根据 S 基因多蛋白共终止密码子原理, 由这 两个 AT G 起始的截短的 HBsAg 蛋白的长度分别
13、 为 152 和124 个氨基酸, 参见图 1。 本研究结合已知 的 HBV S 基 因 序 列 ( GenBank Accession No. AF013631) 2合 成 上 游 引 物 ( PHBS3: 5 -GC CATATGTT GCCCGTT T GTCCT-3 , 黑体字母为 起始密码子, 加下划线部分为 Ndel 位点) 和下游引 物( P66: 5 -CACT GCAGGTT TAAA T GT AT ACC CAAAG-3 , 黑体字母为终止密码的反密码, 加下 划 线部分为 PstI 位点) 。按常规方法进行 PCR, DNA 模板为含 HBV S 基因的重组克隆 pMP
14、s19, PCR 程序为: 94 C/ 30s, 50 C/ 30s, 72 C/ 60s, 26 个 循环。 之后取 6?l 进行琼脂糖凝胶电泳, 可见清晰的 目的DNA 条带( 图从略) 。 2. 2 小 HBsAg3( SHBsAg3) 基因片段的克隆 取 上 述PCR产物, 以NdeI-PstI双酶切后, 与同样双图 1HBV S基因结构及其编码的病毒囊膜蛋白和相 关蛋白的分析Fig 1 Analysis of the HBV S gene and HBV envelope and its related proteins T he SHBsAg3( 124aa) is ex pres
15、sed in this study. 酶切 pUC18 DNA 获得的大片段相连接, 获得了预 期的重组质粒 pHBS3, 经酶切鉴定证明连接正确 ( 图从略) 。 2. 3 SHBsAg3 表达质粒的构建 以 NdeI-SalI 双 酶切含SHBsAg3 编码区的重组质粒 pHBS3 DNA, 回收 390bp 的目的 DNA, 与同样双酶切的 pET -28a ( + ) 载体片段相连接, 获得重组表达质粒 pEHBS3, 见图 2。经 XbaI-XhoI 双酶切证明连接正确( 图从 略) 。图 2 截短的 SHBsAg3 表达质粒的构建Fig 2 Construction of the
16、expression plasmid of the shorted SHBsAg3 fusion protein 2. 4 SHBsAg3 的表达、 SDS-PAGE 分析与蛋白纯 化 按参考文献 4 进行。 该表达产物的氨基末端含 有 6 组氨酸肽段, 全长 144 个氨基酸, 推测分子量为 16178Da, 以包含体形式存在。SDS-PAGE 分析表 明, 表达的融合蛋白大小与预期的相一致, 约占细菌 总蛋白的 22% 。取表达菌经超声波裂解获得包含181第 3 期房德兴, 等 . 乙型肝炎表面抗原 124aa分子在大肠杆菌中的高效表达体, 以 PBSU 溶液( 20mmol/ L 磷酸盐缓冲液, pH7. 4, 0. 5mol/ L NaCl, 8mol/ L 尿素) 溶解包含体后, 进 行 HiTrap 凝胶亲和层析纯化。纯度可达 95% 以上 ( 见图 3) 。图 3 SHBsAg3融合蛋白表达产物的 SDS- PAGE 分析Fig 3 SDS-PAGE analysis of the expressed SHBsAg3 fu
