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1、1培本方拆方调节哮喘大鼠内源性糖皮质激素作用途径的实验研究【摘要 】 目的研究培本方对哮喘大鼠内源性糖皮质激素（GC）各作用途径的调节作用。方法采用 OVA（卵蛋白）致敏、激发复制大鼠慢性哮喘模型，以阿斯美胶囊为对照药，通过放免法检测血清CORT（皮质酮） 、血浆 ACTH（促肾上腺皮质激素）和下丘脑CRH（促肾上腺皮质激素释放激素）的含量及免疫组化法检测肺组织 GCR（糖皮质激素受体）的表达，探讨培本方及其拆方对大鼠哮喘模型的部分作用机制。结果模型对照组较正常对照组 CORT 及ACTH 含量均显著降低、GCR 蛋白表达亦明显降低、CRH 含量无明显改变；培本方全方组及拆方组改善 CORT，
2、ACTH，GCR 的影响作用更为显著。结论 调节内源性 GC 的作用途径可能是培本方抗哮喘作用的机制之一。 【关键词】 培本方 拆方 内源性糖皮质激素 哮喘 大鼠AbstractObjectiveTo study the adjustment of Peibenfang on the functional route of endogenous GC in asthma rats. MethodsAsthma rats model was established by OVA through sensitizing and challenging. Asimei Capsule was 2us
3、ed as positive control medicine. By investigating CORT in blood serum, ACTH in blood plasma, CRH in hypothalamus and GCR in the lung issue, the effects of Peibenfang on asthma were observed.ResultsThe levels of CORT, ACTH and GCR in model group were lower than those in normal group; in Peibenfang gr
4、oup and Peibenfang compatibility group(part), these indexes increased remarkably. ConclusionOne of the mechanisms of Peibenfang against asthma is to adjust the functional route of endogenous GC in asthma.Key wordsPeibenfang; Compatibility; Endogenous GC; Asthma ; Rats哮喘反复发作可导致内源性 GC 浓度下降，体内低浓度的 GC 会
5、加重哮喘的炎症反应，形成恶性循环，同时不足的应激激素反应将增加过敏性哮喘的易感性，也许这是哮喘长期反复发作的机理之一。培本方是由著名老中医徐辉光教授积 30 余年临床之经验，根据中医“久病成虚” “缓则治本”的理论，独树一帜创立的以平补气血阴阳药物为主组成的复方，作为支气管哮喘患者缓解期用药，在临床上取得了较好的疗效。本实验旨在探讨培本方通过调节内源性 GC的作用途径用于哮喘防治的机制。31 材料和方法1.1 动物雄性健康 SD 大鼠，清洁级，60 只，体重（13010）g，由中国科学院上海实验动物中心提供。动物批号：SCXK（沪）2003-0002 。1.2 药品、试剂及仪器大鼠 CORT
6、试剂盒，美国DSL；ACTH 放免试剂盒，北京北方生物技术研究所；神经肽-CRH放免药盒，第二军医大学神经生物学教研室；GCR 一抗（R） ，美国Santa Cruz；免疫组化 EnVision 试剂盒（即用型） ，丹麦 Dako 公司；卵蛋白 OVA，美国 sigma 公司；402A 超声雾化器，江苏鱼跃医疗设备有限公司。实验所需中药材由上海康桥中药饮片有限公司提供。阿斯美胶囊，日本三共株式会社。1.3 动物模型复制 SD 大鼠 60 只，随机分成 6 组，即正常对照组、模型对照组、培本方全方组、培本方拆方组（由全方中补益气血的药物黄芪、当归组成） 、培本方拆方组（由全方中补益阴阳的药物淫羊
7、藿、女贞子组成） 、阿斯美组，每组 10 只。于实验第 0，7 天，除正常对照组给予 1%氢氧化铝佐剂，各组动物均以新鲜配制的致敏液（1 mg/ml OVA，溶于 1%氢氧化铝佐4剂内）作皮下注射，每鼠在两侧后足跖、腹股沟、腰、背、颈部共取 10 点，每点注射 0.05 ml，同时腹腔注射 0.5 ml，共计 1 ml。于实验第 14 天开始，将大鼠置于自制雾化箱（ 40 cm30 cm20 cm）内，用超声雾化器以雾化量 0.8 ml/min 雾化 1%OVA 生理盐水溶液 15 min，1 次/d，以激发哮喘。正常对照组雾化以生理盐水。连续激发 3 周后，停止激发 6 d，然后激发 1 次
8、，24 h 后处死。1.4 给药方法于实验第 14 天开始灌胃给药，1 次/d ，直至处死前 1 日。培本方全方组、培本方拆方 组、培本方拆方 组、阿斯美组，分别按 1 ml/100 g 体重灌胃给予相应的水煎液，给药量分别为 23.2，8.2，9.5，25.11 mgkg-1d-1。正常对照组和模型对照组：按 1 ml/100 g 体重灌胃给予生理盐水。1.5 标本制备及检测血液： 25%乌拉坦 4 ml/kg 腹腔注射，腹主动脉取血， 2 ml 注入事先加入 30 l EDTA-二钠和 40 l 抑肽酶的离心管内，立即颠倒混合，4 静置，离心取血浆；其余血液室温静置后离心，取血清。肺组织：
9、迅速开胸，取出肺组织，适量剪取左肺上部，浸泡于10%中性甲醛缓冲液中固定，脱水石蜡包埋，制成 4 m 厚的切片。5下丘脑：断头，迅速摘取下丘脑，称重后置入液氮内，后转入-70冰箱内冻存。血清 CORT，血浆 ACTH 和下丘脑 CRH 均采用放射免疫分析法检测，实验过程参照试剂盒说明书进行。肺组织 GCR 表达按丹麦 Dako 公司免疫组化试剂盒 Envision系统操作说明进行，每组随机选取 6 张切片，用高清晰度图文分析系统分析 GCR 阳性细胞的平均总面积（average general area）和平均光密度（average OD）值，每张切片取 2 个视野，计算平均值。1.6 统计学
10、分析数据采用s 表示，组间比较采用方差齐性检验及单因素方差分析，相关分析采用线性回归法，所有资料的统计分析均采用 SPSS 11.0 for Windows 软件包完成。2 结果2.1 各组大鼠血清 CORT，血浆 ACTH 和下丘脑 CRH 水平的比较结果见表 1。表 1 培本方拆方对大鼠血清 CORT（略）结果显示，与正常对照组比较，模型对照组血清 CORT 和血浆ACTH 含量显著降低（P0.01 或 P0.05） ，下丘脑 CRH 含量6无明显改变；与模型对照组比较，各给药组均可以显著升高 CORT含量，可明显升高 ACTH 含量的是培本方全方组和培本方拆方组（P0.01） ，明显升高
11、 CRH 含量的是培本方拆方组（P0.05） ；与阿斯美组比较， CORT 含量明显升高的是培本方全方组和拆方组（P0.05 ） ，影响 ACTH 含量有统计学意义的是培本方拆方组（P0.05 ） 。2.2 各组大鼠肺组织 GCR 表达的比较结果见表 2。表 2 培本方拆方对大鼠肺组织 GCR 表达的影响（略）结果显示，GCR 阳性细胞可表达于肺内各级支气管，几乎所有的类型的细胞都可以表达，免疫反应主要定位于胞浆及胞核内（见图 16） 。由表 2 可以看出，与正常对照组比较，模型对照组 GCR阳性细胞的平均面积及平均光密度均明显降低（均为 P0.01） ；与模型对照组比较，培本方全方组及拆方组
12、能明显升高 GCR 阳性细胞的平均面积（分别为 P0.01,P0.05） ，培本方全方组及培本方拆方，组能明显升高平均光密度值（分别为P0.01，P0.05，P0.05） ，阿斯美组无显著影响。2.3 培本方影响哮喘大鼠 CORT 作用的相关性分析结果见表3。结果显示，培本方通过影响内源性 GC 而发挥防治哮喘的作用与ACTH 和 GR 有一定的相关性。表 3 培本方影响哮喘大鼠 CORT 作用的相关分析（略）73 讨 论有不少临床及实验研究表明，哮喘存在下丘脑-垂体- 肾上腺皮质轴不同程度的抑制现象13 ，体内 GC 浓度不足，使哮喘炎症反应加重并增加过敏性哮喘的易感性，也许这是哮喘长期反复
13、发作的机理之一。 GC 在体内发挥作用依赖于与细胞内 GCR 的结合，GCR 是决定靶细胞对 GC 反应性的关键因素之一。 GCR 缺陷在哮喘发病机制中具有重要意义4 ，可能是导致哮喘发展、炎症迁延的重要原因。有研究表明，哮喘患者肾上腺皮质功能尚未受到明显损害，其 GCR 功能即存在异常5 。目前用于治疗哮喘的药物以局部治疗作用为主，亟待加强整体调节药物的研发和应用。以平补气血阴阳立法的培本方，由黄芪、当归、女贞子、淫羊藿等药组成，扶正固本，长于对机体的整体调节。曾通过大鼠同种被动皮肤过敏实验、急性小鼠耳肿胀实验、福氏完全佐剂小鼠气囊法等实验，证实培本方具有良好的抑制炎症介质的释放、抗炎、抗过
14、敏、调节 T 淋巴细胞的免疫功能等作用6，7 ，为进一步研究培本方的作用机制奠定了良好的实验基础。现代药理研究证实方中黄芪能提高血浆皮质醇含量，增强肾上腺皮质的功能，可通过内源性 GC 发挥协同作用，并减少外源性 GC 的应用所引起的不良反应8 ；淫羊藿可保护外源性 GC 对下丘脑-垂体-肾上腺-8胸腺轴形态与功能的抑制，对 NEI（神经-内分泌-免疫）网络调节起重要的作用9 ；补阴药女贞子煎液可促使 ACTH（促肾上腺皮质激素）的合成与释放来影响肾上腺皮质束状带细胞合成与分泌GC10 。基于上述的实验基础，本实验旨在通过观察培本方对哮喘大鼠内源性 GC 各个作用环节的影响，探讨培本方防治哮喘
15、的作用机制。实验结果显示，经抗原激发后，哮喘模型组动物 CORT 和ACTH，GCR 水平显著降低，提示哮喘动物存在内源性 GC 功能缺陷。培本方全方组及拆方，组均能显著改善哮喘大鼠 CORT 水平，可明显升高 ACTH 含量的是培本方全方组和培本方拆方组，能明显升高 GCR 阳性细胞的平均面积和平均光密度值是培本方全方组及拆方组，提示培本方防治哮喘的作用机制与调节内源性 GC有关，且此作用机制与方中补益阴阳的部分关系更为明显。【参考文献】1沈自尹，施赛珠，查良伦，等补肾法防治哮喘及其内分泌和免疫方面的观察J.中医杂志，1981，22（5）：341.2张海波，罗文侗，刘志民支气管哮喘患者外周血
16、白细胞糖皮质激素受体的改变J.第二军医大学学报，1994，15 （ 4）：310.93童舜华，吴敦序，包照日格图，等小青龙汤对哮喘大鼠肺组织糖皮质激素受体和 -受体等水平的影响J.中国中医基础医学杂志，1999，5（3 ）：18.4胡克糖皮质激素受体与支气管哮喘J.国外医学呼吸系统分册，1994，14（2）：61.5刘辉国，牛汝楫，胡道桢支气管哮喘患者外周白细胞糖皮质激素的受体变化J.中华内科杂志，1994，33（3）：150.6郭 忻，毛 平，耿 娅，等培本方抗炎免疫作用的研究J. 中成药，1998，20（7）：28.7郭 忻，冯 怡，符胜光，等培本方抗变态反应的研究J. 中成药，1997，19（12）：31.8石瑞如，刘艳红，翁世艾，等人参、黄芪、枸杞子对老年大鼠一些内分泌激素的调节作用J.中医药学报
