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1、中国医科大学硕士学位论文鼠未成熟缺氧心肌综合心肌保护的实验研究姓名：祝岩申请学位级别：硕士专业：外科学指导教师：谷天祥20030401中文摘要实验目的f 临床上，缺氧紫绀的婴幼儿先心病患者占先心病总数的1 5 3 0 # 0 此类病人心脏手术中的心肌保护一直是心脏外科领域倍受关注的课题。长期以来，低温和介质停搏一直作为此类手术中心肌保护的两大基本要素而被广泛应用。然而随着基于细胞超微结构的基础研究和心血管外科技术的迅猛发展，对于术前心功能差、病情危重复杂的缺氧紫绀婴幼儿先心病患者，单纯采用心肌冷保护的不足之处已经逐渐被认识和证明目前在进行心脏外科手术时冷晶体停搏液( 充氧或不充氧) 、冷血、温
2、血等各种心肌保护方式均得到不同程度的应用，这些方法也各有优缺点。针对于未成熟缺氧心肌，由于其在结构、功能代谢及缺血、缺氧耐受性等方面与成熟心肌存在差异，因此对成熟心肌的保护方法不一定适宜于未成熟缺氧心肌。哪一种心肌保护方法最理想，是当前国内外研究的重点。我们针对此类病人，借鉴B u c k b e r g 等最近提出的观点，在心脏外科手术中采用一体化综合心肌保护( i n t e g r a t e dm y o c a r d i a lp r o t e c t i o n ) 的方法，拟通过基础实验研究比较各种心肌保护方法对缺氧心肌保护作用的的优劣，评价一体化综合心肌保护效果。并试图探讨
3、未成熟心肌缺血再灌注损伤的发生机制，为今后如何减轻心肌损作提供理论基础和实践经验。另外氨基酸作为心肌有氧代谢的三羧酸循环底物，在婴幼儿心肌保护中因能明显减轻缺血、缺氧心肌的再灌注损伤而日益受到重视。本实验同时探讨了富含氨基酸成分的心脏停搏液的保护效果。实验方法我们选取心肌未成熟的雄性W i s t a r 大鼠，建立紫绀缺氧动物模型。然后将4 0 只未成熟缺氧鼠随机分为5 组：1 冷晶体停搏液 组( C c ) ；2 冷血停搏液组( C B ) ；3 温血诱导冷血序灌加终末温血 停搏液组( 序灌组W B ) ；4 温血诱导冷血序灌加终末温血再加氨基酸强化停搏液组( 强化序灌组W B A ) ；
4、5 对照组( C O N ) 等5 组。 单盲法相互对照各组问的差异，观察及检测实验前后心脏灌注模型的血流动力学、能量代谢、心肌酶学、再灌注损伤程度、心肌超微结构及损伤后即刻早期基因c l o s ，c j u n 的表达程度等各项指标。探讨温血加用冷血停搏液综合心肌保护对于未成熟缺氧心肌的优越性及其机制。实验结果实验中我们建立的动物模型在能量代谢，血气结果，心肌损伤程度等几方面均能够较好地模拟临床紫绀型先心病患儿的缺氧状态，使得实验有了可信的基础。实验结束后，在复跳过程中除冷晶 体停搏液组有1 例需经人工辅助外，各组大部分离体心脏均能在 较短的时间内不同程度地恢复心搏。W B 组和W B A
5、 组复跳较好( P O 0 5 ) 。心 肌细胞再灌注损伤指标显示C c 组心肌所受损伤最为严重，W B A2 组最轻，各组之间均存在显著的差异( P O 。0 5 ) T h er e s u l t so fm y o e a r d i u mr e p e r f u s i o ni m p a i r m e n ti n d i c a t e st h a tt h ei m p a i r m e n ti nC Cg r o u pi sm o s tB e v e r e ，a n dt h eW B Ag r o u pi sg e n t l e s t T h ed
6、 i f f e r e n c eb e t w e e ng r o u p si sa p p a r e n t ( P ，体重接近，均为雄性，所有大鼠依据前述实验方法建立紫绀缺氧动裙模型。隧视分秀5 组如下：l全程冷晶体停搏液组( C C ) ；2 全程冷血停簿液组( c s ) ；3 温盔诱 导冷血序灌加终末温皿停搏液组( W B ) ；4 温血诱导冷血序灌加终末温血再加氨基酸强化停搏液组( W S A ) ；5 对照组( C O N ) 。二、对照设立采用相互对照的方法。相互对照各组闯的差弊。三、实验设计单盲法进行实验。四、相关液体配制( 以下药品如无特殊指明，均由沈阻军区总医院
7、制剂室提供)1 K r e b s H e n s e l e i t 离体心脏灌流缓冲液表4 按K r e b s H e n s e l e i t 液基本成份配制( 单位：r e t o o l 1 )N 8 c 王x c lC B c kM 毋吼分子量5 8 57 4 51 1 11 2 0摩尔旅度1 1 84 92 51 2N a 2 S O sr q t a t c o , K I - 1 2 P O s 葡萄糖肝素2 4 6“1 3 6l 一0 52 31 21 25 0 0 U L灌流时持续充入9 5 0 ：，5 C 0 2 ，蛊气分耩测定氧分压戈 2 0 0 m m H g
8、，二氧纯碳分压为4 0 m m r t g ，P 肿4 7 。5 ，温度设定为3 7 。2 F r e m e 氏液基本成分1 9 表5F r e m e 液浓度( 单位：r e t o o L 1 )3 晶体停搏液的配制 采用目前临床常用的细胞外液型心肌保护液S T T h o m a sI I ，成分如下：表6晶体停搏液离子含量浓度( 单位：m m o l lO S3 2 4 m m 0 1 k g I t OP H7 8 )灌流时持续充入1 0 0 医用氧，氧分压为2 0 0 m m H g ，调节温度设定为4 备用。4 冷、温含血停搏液配制实验前每只次鼠所需要的血液均熏新采同种新鲜血配
9、置以保证实验结果的效果和可比性。另选体型较大的成熟大鼠作为供血大鼠，大鼠处死3 0 分钟前腹腔内注射肝素钠1 5 0 0 I U 抗凝，异戊巴比妥钠( 3 0 m g k g ) 麻醉，大鼠麻醉成功后，迅速自剑突剪开下至腹腔，向上至胸腔，将心脏取下排净血液后移除。用已肝素化除去针 头的2 0I l l l 注射器将纵隔内的血液仔细缓慢吸出，避免溶血及吸到飘浮的鼠毛和组织碎屑。一般每只鼠可以回收到5 1 0n l l 。整2 0 个实验大约需要血液停搏液3 5 4 0m l 。加入C P D 腺嘌呤后可置于冰箱内冷藏保存。使用前首先加入平衡液按1 ：1 稀释后，再按4 ：1 的比例分别加入F r
10、 e m e 氏高钾或低钾液( 见表2 ) 制成温血及冷血停搏液，测得H C T ：1 9 1 ，H b ；5 14 - I g L ，p H 7 6 O 5 ，这与我们在临床上常用的相似，各离子浓度详见：表7 停搏液离子成分表。充入医用1 0 0 氧，氧分压为2 5 0 3 0 0 m m H g ，C B C 组降温至4 0 C ，W B C 组温浴到3 7 ，经滤网过滤后使用。5 氨基酸强化停搏液的配制W B A 组血液停搏液中分别加入上海康达制药厂生产的L 一 谷氨酸，L 一天门冬氨酸( 批号2 0 0 2 1 一l O ) 使其浓度达到2 0 m m o l L ，同上法充氧及调节离
11、子浓度后备用。实验中各种心脏停搏液主要离子成分见下表：表7 停搏液离子成分表( 单位：r e t o o l 1 )2 l 五、实验器材1 L a n g e n d o f f 灌注模型装置( 如下图)2 带软木塞的广口烧瓶1 5 X 2 0 e m3 大小烧杯若干4 氧气瓶5 架盘药物天平北京宣武天平厂。6 霍耶尔秒表瑞士H E U E R 公司7 L w 一1 力一位移换能器上海红旗仪表厂8 3 7 3 0 0 3 型台式平衡记录仪上海大华仪表厂9 电动高速离心沉淀机无锡新南制造厂1 0 Y X G S 4 6 2 8 型电压力蒸汽消毒器宁波镇海医疗器具厂 1 1 三用电热恒温水浴箱S
12、H H W 2 1 一C6 0 0 北京长安科学 仪器厂1 2 离心沉淀机L X J I I 上海医疗器械三厂1 3 超声细胞粉碎机K S 一1 5 0 宁波科生仪器厂1 4 光栅分光光度计7 2 2 型上海第三分析仪器厂 1 5 P H 仪2 2 六、实验示意图0 2 1 C O zL a n g e n d o r f f R e 翱虻v O i r9 0 c r nH e m o d y n a r r l i c R e c o r d e r图4 实验中使用的改进后的L a n 胂n d o 虚灌注模式图7 】2 3 七、实验方法1 建立离体缺氧鼠心工作模型 依前述缺氧鼠心模型参照L
13、 a n g e n d o r f f 等的方法建立离体鼠 心灌注模型：处死大鼠3 0 分钟前腹腔内注射肝素钠5 0 0 I U ，异戊巴比妥钠( 4 0 r a g k g ) 麻醉后，迅速自剑突剪开胸壁，下至腹腔，上至胸腔，于主动脉分叉前剪断主动脉及其他连带组织，将心脏取下，立即置入带有冰屑的冷灌流缓冲液中，心脏很快停跳。修剪大血管后将升主动脉套扎在L a n g e n d o r f f 灌注装置上。整个取心过 程 ：依试剂盒使用说明书。超氧化物歧化酶( S O D ) ( 化学比色法) ：依试剂盒使用说明书。“) 心肌再灌注损伤指标：收集恢复K H 液灌注后3 分钟冠脉引流液3 0
14、 0 0 转分低温高速离心后取上清液测定汹瑚 3 l 】。肌钙蛋白c T n I ：由德国产C A R I A CR E A D E R 7 5 0 自动完 成检测( 由解放军沈阳军区总医院全军心血管疾病中心内外科研究所试验中心提供，下同) 。 C K ：动态法检测由美国产M D 一1 0 0C o m p u t e r i z e dC l i n i c a lC h e m i s t r yA n a l y z e r 自动完成检测。 C K M B ：动态法检测由美国产M D 一1 0 0C o m p u t e r i z e dC l i n i c a lC h e m
15、i s t r yA n a l y z e r 自动完成检测。L D H ：动态法检测由美国产M D 一1 0 0C o m p u t e r i z e dC l i n i c a lC h e m i s t r yA n a l y z e r 自动完成检测。( 跏心肌即刻早期基因表达：c l o s ，c j u n 。 1 ) 实验试剂淋巴细胞分离液为上海试剂厂品；T r i z o l 试剂为P r o m a g a 公 司产品；逆转录试剂盒为T a R a 产品；P C R 引物由中科院上海细胞生物所提供，序列如下文；T a q 酶为T a K a R a 产品；M a
16、r k e r 为T a K a R a 产品；琼脂糖为G i b e c o 产品；溴化乙锭为F l u k a 产品 2 ) 实验仪器Z 3 8 3 K 型低温高速离心机，德国H E R M L E 公司产品；P T C 一2 8 i 0 0P C R 扩增仪，美国M J R e s e a r c h 公司产品；P A C 3 0 0 0 电泳仪，美国B I O R A D 公司产品；W F H 一2 0 2 P C R 紫外透射仪，上海精益仪器厂产品；I D K 一1 成像分析系统，美国K O D A K 公司产品。3 ) 实验方法检测方法：逆转录一多聚酶链式反应( R v e r s eT r a n s e r i p t i o n P o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，R T P C R )
