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1、项目名称： 神经元信息感受重要蛋白质膜转运的结神经元信息感受重要蛋白质膜转运的结构基础、调控及功能研究构基础、调控及功能研究首席科学家： 罗建红罗建红 浙江大学浙江大学起止年限： 20102010 年年 1 1 月月-2014-2014 年年 8 8 月月依托部门： 教育部教育部一、研究内容（1）离子通道和受体的内质网质量控制机制：系统分析电压门控钠离子和钙离子通道、谷氨酸受体通道及 G 蛋白偶联受体的内质网驻留/返流信号，发现新的内质网驻留/返流信号和关键结构域，筛选参与离子通道/受体内质网质量控制的关键相互作用蛋白，探讨蛋白磷酸化的调节作用，提出内质网质量控制新的分子机制；（2）离子通道和
2、受体的囊泡分选、转运和调节机制：分析离子通道/受体转运的囊泡类型和转运模式，筛选和鉴定与转运环节相关的蛋白质复合物组分、离子通道和受体分选的分子内部信号及其相互作用和调控机制，研究马达蛋白和细胞骨架在离子通道和受体的囊泡和细胞器转运中的作用和机制；（3）受体膜表面和突触定位、内化及再循环过程及其机制：分析谷氨酸受体、G 蛋白偶联受体及酪氨酸激酶受体在神经元膜表面分布、突触定位、内化及再循环的分子和细胞机制，解析相关的受体结构域、调控位点及相互作用蛋白，探讨磷酸化和泛素化对相关环节的调控；（4）离子通道的膜转运与神经元兴奋性调控：探讨电压门控钠离子和钙离子通道转运插入细胞膜数量的调控机制，分析离
3、子通道在细胞膜上数量的改变对其电流和神经元兴奋性变化的贡献，提出离子通道膜转运调控神经元递质释放和信号传导的新机制；（5）突触后受体的动态变化与突触可塑性：研究在突触可塑性产生过程中突触后受体（特别是谷氨酸能受体）的数量和构成的动态变化及其受体亚型对不同类型突触可塑性形成的作用，探讨关键激酶和磷酸酶参与该过程协同调控机制，提出调节受体转运影响突触可塑性的新机制。二、预期目标（一）总体目标（一）总体目标高度特化的神经元是神经网络形成和神经信息正确处理的结构和功能基础，而负责信息感受的离子通道和受体蛋白在神经元的正确定位和动态调节对此具有特殊重要的意义。本项目整合了在相关领域已做出优秀工作的科学家
4、，拟选择一组与神经信息感受和传导密切相关的离子通道和受体蛋白，系统研究其膜转运的关键结构域、相互作用蛋白质、磷酸化等调节及对神经元兴奋性和突触功能的调控。通过发现新机制和新规律，加深对神经信息处理过程中关键蛋白质分子结构和功能基础及其相互关系的理解。通过该项目的实施获得一系列具有国际领先和拥有自主知识产权的研究成果，同时凝聚和造就一支在该领域达到国际先进水平的研究队伍。（二）五年预期目标（二）五年预期目标1. 在基础理论研究方面在基础理论研究方面：（1（ 系统分析电压门控钠离子和钙离子通道、谷氨酸受体通道、G 蛋白偶联受体及酪氨酸激酶受体膜转运所依赖的分子内部信号和关键结构域，重点解析并得到若
5、干新的内质网驻留/返流、内吞和再循环、囊泡转运和分选的信号或关键结构域；（2（ 鉴定参与电压门控钠离子和钙离子通道、谷氨酸受体通道、G 蛋白偶联受体及酪氨酸激酶受体膜转运的关键相互作用蛋白，阐明磷酸化或泛素化对蛋白相互作用的调控机制，提出新的蛋白相互作用模型；（3（ 阐述电压门控钠离子和钙离子通道、谷氨酸受体通道、G 蛋白偶联受体及酪氨酸激酶受体膜转运对神经元兴奋性和突触可塑性的调控作用，深化离子通道和受体膜转运对神经信息处理调控的认识。2. 成果考成果考核指标核指标： 在国际一流杂志（IF10）发表论文 5 - 8 篇，在有影响力的杂志（IF5）上发表论文 25 - 30 篇。3. 人才培养
6、人才培养：培养研究生 50 - 80 人，培养出学科领军型人才 3 - 5 名。三、研究方案（一）（一） 学术思路学术思路蛋白质是生命活动也是神经信息处理的主要执行者，其功能具有不同层次的解析。蛋白质本身的结构和功能是一个基本层次，然而，细胞内大多数蛋白质则通过蛋白质蛋白质的相互作用、蛋白质复合物及其网络的形成、以及与亚细胞结构复杂的相互作用等才最后达成具有细胞生理学意义的功能，这里包含了蛋白质表征细胞生命活动时所需要的精确、有序的时空调控。神经元信息神经元信息处理相关的离子通道和受体如何通过其分子内部信号、关键结构域和相互作用处理相关的离子通道和受体如何通过其分子内部信号、关键结构域和相互作
7、用蛋白来决定和调节膜转运，达成正确的分布和定位并实现其在神经元中的功能，蛋白来决定和调节膜转运，达成正确的分布和定位并实现其在神经元中的功能，这是一个蛋白质科学与神经科学相结合的重要前沿科学问题。这是一个蛋白质科学与神经科学相结合的重要前沿科学问题。本项目以理解神经信息处理为引导，以与神经信息感受和传导相关的一组离子通道和受体为研究对象，围绕膜转运（内质网质量控制、囊泡分选和转运、膜和突触定位及内化再循环）这条主线，采用分子生物学、分子遗传学、生物化学、蛋白组学、组织细胞免疫化学、活细胞荧光成像和电生理学等多层次先进研究技术组合，以解析蛋白质分子内部信号或结构域、鉴定相互作用蛋白质、阐明调控机
8、制及与神经元信息处理关系为立足点，对上述的蛋白质活动过程中结构和功能的基本问题进行系统研究（见下图） ，力争做出国际领先水平的研究工作，提升我国在该领域的学术地位。（二）（二） 技术途径技术途径本项目选择的研究对象是一组与神经信息感受和传导相关的膜蛋白，对其膜转运及调控的研究手段上具有共性，但针对膜转运的不同环节、调控机制及功能关系等研究又需要有不同的技术组合。总体来说，本项目对研究内容和目标强调整体设计，结合原有的研究基础，将同时采用假设驱动和探索驱动的研究策略。强调综合运用基因、蛋白质、细胞组织及整体多层次现代生物学研究技术，对目标蛋白质膜转运不同环节的机制进行解析，着眼于解析蛋白质（包括
9、新鉴定的相互作用蛋白质）内部信号或关键结构域、相互作用机制、膜和突触定位及动态转运、磷酸化等修饰调节机制，以达成对神经元兴奋性和突触功能调节更为深入的理解。离子通道和受体的内质网质量控制机制离子通道和受体的内质网质量控制机制离子通道/受体要表达到细胞膜上并履行其功能，必须首先要通过内质网的质量监控。只有正确折叠，装配，暴露出一些前向运输信号或者屏蔽掉 ER 滞留/返流信号，甚至是具备正常功能的离子通道/受体才能表达到细胞膜上。否则，它们将被滞留在内质网，或者启动内质网相关降解途径（ER associated degradation, ERAD）被降解，或者因过分堆积而引起相应的病理过程。到目前
10、为止，一些神经系统相关的重要离子通道/受体的内质网质控机制并不是非常清楚，即便有些离子通道/受体虽然鉴定出存在某种内质网驻留/返流信号，但是神经元信息感受和传导相关的重要蛋白电压门控 离子通道离子型谷 氨酸受体G蛋白偶 联受体酪氨酸激 酶受体结构相关信息的分析结构相关信息的分析 内部信号或关键结构内部信号或关键结构 域的鉴定域的鉴定分子及遗传学技术分子及遗传学技术 （基因突变和基因敲除）（基因突变和基因敲除）组织细胞免疫化学和组织细胞免疫化学和 活细胞荧光成像技术活细胞荧光成像技术总体研究方案的学术思路和技术途径示意图总体研究方案的学术思路和技术途径示意图电生理技术电生理技术 和药理学方法和药
11、理学方法生物化学技术生物化学技术 （生化及蛋白质组学技术）（生化及蛋白质组学技术）神经信息传导 和可塑性调控蛋白质相互作用：蛋白质相互作用： 1.新蛋白质的鉴定新蛋白质的鉴定 2.分子机制研究分子机制研究亚细胞定位亚细胞定位/ /动态转运动态转运蛋白质磷酸化等修饰蛋白质磷酸化等修饰囊泡分选 和转运膜和突触 定位内化和 再循环内质网 质量控制膜 蛋 白 转 运 和 定 位 环 节神经系统信息处理神经元兴奋性和神经元兴奋性和 突触功能调节突触功能调节其内在的分子机制不是非常清楚，这些信号是如何发挥作用，又是如何被屏蔽的还需要进一步探讨。因此，我们拟以电压门控钠离子通道，配体门控离子通道谷氨酸受体为
12、模型，结合分子克隆技术，免疫荧光技术，FRAP/FLIP,蛋白电泳技术及电生理技术等系统分析其内质网滞留的分子机制，发现新的内质网驻留/返流信号和/或关键结构域，然后通过双相蛋白电泳技术，质谱分析等筛选参与其内质网质量控制相关的关键作用蛋白，提出内质网质量控制新的分子模型；并进一步探讨炎性因子和各信号途径对电压门控钠离子通道，谷氨酸受体内质网质量控制及内质网驻留/返流信号的调节作用。离子通道和受体的内质网质量控制机制研究技术途径示意图离子通道和受体的内质网质量控制机制研究技术途径示意图离子通道和受体的囊泡分选、转运和调节机制离子通道和受体的囊泡分选、转运和调节机制离子通道和受体的囊泡分选、转运
13、和调节机制离子通道和受体的囊泡分选、转运和调节机制神经元的轴突和树突是神经元与神经元相互信息传递及感受外界化学和物理信息的最主要的部位，主要负责信息感受的离子通道和受体在神经元的胞体合成后，要通过囊泡转运到细胞膜，这些囊泡更要通过轴浆运输的方式向轴突和树突转运（正向运输） ，插入到轴突和树突的细胞膜上，介导神经元的信息加工过程。同时，神经末梢的一些受体在受到其激动剂的作用后被激活，进入内吞小体的囊泡状结构，经轴浆运输的方式将信号传递到胞体（逆向运输） ，影响神经元中一些基因的表达调控，从而调节神经元的功能。目前，在离子通道/受体转运的囊泡类型、转运模式、蛋白序列的结构基础、相互作用蛋白和调控机
14、制方面远未阐述清楚。因此，本研究将以电压门控的钠离子通道和钙离子通道、配体门控的离子通道（谷氨酸受体、P2X3受体和 TRPV1 受体）等的囊泡转运作为切入点，利用分子克隆、神经元培养和转染、活细胞成像技术动态描述离子通道/受体转运的囊泡类型和转运模式，采用囊泡分离、免疫共沉淀和质谱等方法和技术鉴定与转运环节相关的蛋白质复合物组分及相互作用，用基因过表达和沉默方法区分相互作用蛋白对离子通道/受体转运的重要性，结合基因定点突变和删减筛选决定离子通道和受体囊泡分选的分子内部信号和相互作用蛋白的结构基础，选择不同外界信号刺激和信号通路激活模式观察分子内部信号和相互作用蛋白的关键结构域在调控离子通道/
15、受体囊泡转运中的机制，重点关注马达蛋白和细胞骨架的磷酸化和乙酰化调控作用，最终加深离子通道/受体囊泡转运调控机制对神经元兴奋性和突触可塑性的理解。离子通道和受体的囊泡分选、转运和调节机制研究技术途径示意图离子通道和受体的囊泡分选、转运和调节机制研究技术途径示意图受体膜表面和突触定位、内化及再循环过程及机制受体膜表面和突触定位、内化及再循环过程及机制神经元受体/离子通道转运到细胞膜或突触部位是其感受胞外信号并发挥正常功能的必要条件，这种定向转运通常依赖于胞内复杂的蛋白质运输调控机制来完成。受体膜表面和突触定位、内化及再循环过程的调控，依赖于受体分子中特定的结构序列以及一系列与能与该结构序列结合的
16、分选蛋白质分子，这些分选分子与目的蛋白质中的特定序列相结合，帮助目的蛋白质定向转运。不同受体决定其膜表面和突触定位、内化及再循环过程的结构序列以及相对应的分选蛋白质分子各不相同，这也是不同神经元受体膜表面胞内定位及运输不同的原因，因此有必要全面地建立神经元受体胞内运输的结构与相互作用蛋白质的调控网络。因此，本研究将以谷氨酸受体、G 蛋白偶联受体（甘丙肽受体和CCR2 受体）及酪氨酸激酶受体（TrkB 和 ErbB 受体）为研究对象，利用包括免疫共沉淀、液-质联用质谱技术、酵母双杂交等大规模筛选和鉴定等手段，系统地筛选蛋白质转运相关复合物，然后将应用包括免疫细胞化学染色、免疫电镜、实时动态荧光追踪、荧光相关光谱分析(FCS)、光漂白后荧光恢复术（FRAP） 、荧光共振能量转移术 (FRET)、全内反射荧光显微术（TIRFM）等成像技术进行亚细胞定位和实时动态分析并结合基因操作、电生理和动物模型等技术对其进行深入的结构和功能研究，解析这些蛋白质分子是如何通过与相应受体中的特定结构域结合，调控受体膜表面和突触定位、内化及再循环过程，进而影响到受体功能的执行，调控突触可塑性及神经信号的
