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1、RACE（rapid amplification of cDNA ends）技术的原理和操作）技术的原理和操作 近年来随着生物技术的不断发展，出现了许多克隆新基因的方法和手段，如图谱克隆技术、转座子标签技术、mRNA差异显示技术、基因组减法技术以及cDNA文库筛选技术等。但上述方法大多具有实验周期长、技术步骤烦琐且工作量大等特点。cDNA末端快速扩增技术（末端快速扩增技术（rapid amplification of cDNA ends，RACE）是一种基于）是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的的 5和和 3末端的有效方法末端的有效方法，以其简单、快速
2、、廉价等优势而受到越来越多的重视。 经典的RACE技术是由Frohman等（1988）发明的一项技术，主要通过RT-PCR技术由已知部分cDNA序列来得到完整的cDNA 5 和 3 端，包括单边PCR和锚定PCR。该技术提出以来经过不断发展和完善，克服了早期技术步骤多、时间长、特异性差的缺点（Frohm等，1995：Schaefer，l995： Chen，1998： Bespalova等，1998： Matz等 11999）。 an对传统对传统 RACE 技术的改进主要是引物设计及技术的改进主要是引物设计及 RT-PCR 技术的改进：技术的改进： 改进之一是利用锁定引物（利用锁定引物（lock
3、 docking primer）合成第一链）合成第一链 cDNA，即在 oligo(dT)引物的 3 端引入两个简并的核苷酸5-Oligo(dT)16-30MN-3，M=A/G/C；N=A/G/C/T，使引物定位在poly(A)尾的起始点， 从而消除了在合成第一条cDNA链时oligo(dT)与poly(A)尾的任何部位的结合所带来的影响； 改进之二是在5 端加尾端加尾时，采用poly(C)，而不是 poly(A)； 改进之三是采用 RNase H-莫洛尼氏鼠白血病毒（MMLV）反转录酶或选择嗜热 DNA聚合酶可能在高温（6070）有效地逆转录 mRNA，从而消除了 5 端由于高 CC 含量导
4、致的 mRNA 二级结构对逆转录的影响； 改进之四是采用热启动热启动 PCR （hot start PCR）技术和降落降落 PCR（touch down PCR）提高 PCR 反应的特异性。 随着 RACE 技术日益完善，目前己有商业化 RACE 技术产品推出，如 CLONTECH 的MarathoTM 技术和 SMARTTM RACE 技术。邢桂春等（2001）先后使用上述两种试剂盒进行 RACE 反应， 结果发现使用 MarathonTM 所得到的片断总是比采用 SMARTTM RACE试剂盒到所得到的片断短。其原因在于 MarathonTM 技术反转录反应往往不能真正达到mRNA 的 5
5、 末端。所以认为，进行 RACE 反应应当优选 SMARTTM RACE 试剂盒。以下就国内目前应用最广的 SMARTTM RACE 试剂盒为例，简要概述 RACE 技术的原理和操作过程。 SMARTTM 3-RACE原理原理 利用 mRNA 的3 末端的末端的 poly(A)尾巴作为一个引物结合位点尾巴作为一个引物结合位点，以连有以连有 SMART 寡核苷酸序列通用接头引物的寡核苷酸序列通用接头引物的 Oligo(dT)30MN 作为锁定引物作为锁定引物反转录合成标准第一链 cDNA。然后用一个基因特异引物基因特异引物 GSP1（gene specific primer，GSP）作为上游引物
6、，用一个含有部分接头序列的通用引物通用引物 UPM（universal primer，UPM）作为下游引物，以 cDNA 第一链为模板，进行 PCR 循环，把目的基因 3 末端的 DNA 片段扩增出来。（见下图） SMARTTM 5-RACE原理原理 先利用 mRNA 的3末端的末端的 poly(A)尾巴作为一个引物结合位点尾巴作为一个引物结合位点，以Oligo(dT)30MN作为锁定引物作为锁定引物在反转录酶 MMLV 作用下，反转录合成标准第一链 cDNA。利用该反转录酶具有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的5 末端末端时自动加上加上 3-5 个个(dC)残基残基，退火后(dC)残基与
7、含有残基与含有SMART寡核苷酸序列寡核苷酸序列Oligo(dG)通用接头引物配对通用接头引物配对后， 转换为以SMART序列为模板继续延伸而连上通用接头（见下图）。然后用一个含有部分接头序列的通用引物通用引物UPM（universal primer， UPM） 作为上游引物， 用一个基因特异引物基因特异引物2 （GSP 2 genespecific primer，GSP）作为下游引物，以 SMART 第一链 cDNA 为模板，进行 PCR 循环，把目的基因 5末端的 cDNA 片段扩增出来。 最终，从 2 个有相互重叠序列的 3/ 5-RACE 产物中获得全长 cDNA，或者通过分析RACE
8、 产物的 3和 5端序列，合成相应引物扩增出全长 cDNA。 实验中发现，做 RACE 反应实验实际操作中仍存在不少困难。因此，对 RACE 反应条件进行反复摸索是十分必要的。这是因为： 1. 在 5-RACE 包含了有 3 个连续的酶反应步骤（反转录、同聚物加尾和 PCR 扩增），每一步都可能导致失败； 2. 扩增 DNA 末端的特异性完全依赖锚定引物及扩增 DNA 模板样品的不均一性， 因而特异性一般很低，常呈现不清晰的成片条带或截短的产物背景。因此，使用 RACE 技术扩增得到的特异末端片段，所获得的重组克隆最好能够全部测序，以排除 RACE 实验结果中扩增产物假阳性和假阴性，最终有可能获得新基因的全序列。 随着 RACE 的不断改进和完善，优化条件下 PCR 扩增效率和忠实性的提高及 PCR 产物克隆技术的迅速发展，RACE 必将在基因克隆及基因表达研究中发挥越来越大的作用。 RACE 的另一种代表方法的另一种代表方法-Self-Ligation 法法 反转录(RT)反应-Hybrid RNA 的分解-单链 cDNA 的自身连接-PCR 扩增 5未知区域-目的 DNA 片段的切胶回收-DNA 序列测定
