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1、2011年2月? ? ? ? ? 第 32卷? 第 1期? ? ? ?首 都 医 科 大 学 学 报 Journal of CapitalM edicalUniversity? ? ?Feb. 2011 Vo. l 32? No . 1 do: i 10. 3969/j . issn . 1006?7795 . 2011 . 01 . 027? 基础研究 ?抑癌基因 RAS启动子甲基化与乳头状甲状腺癌的关系戴亚丽1? 蔡德鸿2 *? 张 ? 桦2? 张? 震2? 陈? 宏2? 李? 静2( 1. 北京大学深圳医院内分泌科; 2. 南方医科大学珠江医院内分泌科 )摘要!? 目的? 观察抑癌基因
2、RAS在乳头状甲状腺癌 ( papillary thyroid carcino ma , PTC)中的表达, 分析其启动子甲基化与肿瘤发生的关系。方法? 选择 50例 PTC和 32例良性甲状腺肿瘤 (对照组, 包括 20例结节性甲状腺肿, 12例甲状腺腺瘤 )患者, 对 2组患者手术获取的标本提取 RNA 后, 反转录为 cDNA, 进行多聚酶链反应 ( poly merase chain reaction, PCR), 检测 RAS基因的表达情况; 运用甲基化特异性 PCR(methylation?specific PCR, MSP)检测上述组织中 RAS基因启动子区甲基化的情况, 并对
3、2种抑癌基因甲基化和未甲基化的组织随机进行测序。结果? PTC组患者中, 有 30例 ( 60 % )RAS基因启动子发生甲基化; 对照组患者中,有 10例 ( 31. 3 % )RAS基因启动子发生甲基化; PTC组织 RAS基因启动子甲基化率均显著高于对照组, 差异有统计学意义 (?2=6. 46, P0 . 05); 对照组织发生甲基化的其 mRNA半定量表达值为 0 . 62 0 . 12 , 未发生甲基化的其 mRNA半定量表达值为 0 . 69 0 . 13 , 两者差异也无统计学意义 ( t= 1 . 48 , P 0 . 05)。图 3? RAS 基因 mRNA的 RT?PCR
4、电泳图 Fig . 3?RT?PCR analysis ofRAS mRNA Marker : 100 bp DNA ladder ; U , W, Y, Z :controls ; G, H , , I K, L , O, X: PTCs ;the lower line: RAS gene;the upper line : GAPDH gene; GAPDH : g lyceraldehyde?3?phosphate de? hydrogenase; PTC :papillary thyroid carcinoma; PCR :poly? merase cha in reaction .3?
5、 讨论RASSF1A 基因在正常组织中广泛表达, 而在肿瘤中表达经常缺失, 被认为是人类肿瘤中经常失活的抑癌基因 5。RASSF1A 基因启动子超甲基化是其失表达的重要途径, 在肿瘤发生发展中可能起着重要的作 用。已有研究 6表明 RASSF1A 基因失活的主要机制并不是编码区基因突变 ( 2 % ), 而是启动子甲基化和杂合子丢失, 其甲基化水平与很多肿瘤的发生、 浸 润、 转移和预后相关。甲状腺肿瘤在内分泌系统是最常见的肿瘤, 大部分是上皮性甲状腺癌, 主要为滤泡型和 PTC。像其他 系统的肿瘤一样, 基因的改变长期以来被认为在甲状腺肿瘤的发生中起到一个基本的作用。表观遗传学的改变, 例如
6、异常的启动子区甲基化, 在肿瘤形成中是很常见、 很重要的机制, 对于甲状腺癌形成来讲, 可 能是一个可以替代基因突变的机制。Schagdarsurengin U等 4通过 MSP法检测甲状腺癌中 RASSF1 A 启动子甲基化情况, 发现在 38例原发性甲状腺癌中,71 % 的样本存在 RASSF1 A CpG岛的 高甲基化, 其中乳头状癌的甲基化率为 62 % ( 8/13),137首 都 医 科 大 学 学 报第 32卷在 9个甲状腺癌细胞系中完全甲基化, 其基因表达缺 失, 经去甲基化处理后其基因表达恢复。XingM 等 7用适时定量 MSP研究了包括良性腺瘤在内的各种甲状腺肿瘤中 RA
7、SSF1 A 的甲基化状况。结果发现, RASSF1A 的异常甲基化在早期的良性腺瘤即是一个多发事件 ( 44 % ), 而在滤泡型甲状腺癌中甲基化水平更显著 ( 75 % ), 但在乳头状甲状腺癌中发生率仅20%。他们认为 RASSF1 A 启动子区 CpG岛的高甲基 化能致 RASSF 1 A 基因的转录失活, 这种表遗传的失活是甲状腺肿瘤发生中的一个早期步骤, 在甲状腺肿瘤的恶性发展中可能发挥着重大的作用。王新华等 8用 MSP技术在甲状腺乳头状癌组织中发现 RASSF1 A 基因甲基化率为 68 . 6 % ( 35/51), 而正常甲状腺组织中未检测到该基因的甲基化。唐建东等 9用
8、MSP法在甲状腺乳头状癌组织中发现 RASSF 1 A 基因启动子 甲基化的发生率为 55 . 9 % ( 19/34), 癌旁组织中甲基化的发生率为 23 . 5% ( 8/34), 认为甲基化可能与甲状腺乳头状癌发生发展过程有关。我们使用反转录 PCR法和 MSP法, 检测了 50例 PTC组织和 32例对照组织 RAS 基因启动子甲基化和mRNA的表达情况, 发现了RAS基因启动子在 PTC中的甲基化频率明显高于对照组, 两者差异具有统计学意义 (P 0 . 05); RAS 基因 mRNA在 PTC中表达明显低于对照组织 (P 0 . 05); 但对于进一步分层分析发现, 在 PTC组
9、和对照组,发生甲基化与未发生甲基化的 mRNA的表达差异并无统计学意义, 分析其可能原因为: 在乳头 状甲状腺癌中除甲基化外, 估计还有其他介导 RAS 基因表达下调的表遗传学改变, 诸如调控区的碱基变异和调控相关蛋白的表达异常等都可能影响它们的转录; ( 在 被检测的癌组织内除了甲基化的癌细胞外, 还有未发生甲基化的癌细胞,这些细胞中RAS基因的正常表达, 掩盖了甲基化的影响。最后为了证实甲基化的存在, 对 RAS基因发生甲基化和未甲基化的标本进行了测序, 测序结 果表明证实了 RAS基因启动子 CpG岛的所有 Cp G位点均发生了甲基化,即甲基化引物扩增产物中的 Cp G位点的 C仍然保持
10、 C , 而非甲基化引物扩增产物中的 Cp G位点中的 C转变为 T(亚硫酸氢盐可以将没有甲基化的胞 嘧啶转化为尿嘧啶, 而在适当的实验条件下已经甲基化的胞嘧啶保持不变; 经 PCR扩增后, CpG位点发生甲基化的, C仍然保持 C, Cp G位点未发生甲基化的, C转变 为 T)。仅从我们的研究结果表明, 在 PTC中, RAS基因启动子的高甲基化可能抑制了 RAS 基因的表达, 使得RAS基因对 PTC的抑制作用减少, 从而促进了 PTC的发 生和发展。因此, 我们的研究提供了证据: 在 PTC中异常的 DNA甲基化可能是 RAS基因沉寂的一个重要机制。总体来讲, 我们在 PTC的研究展示
11、了 RAS基因异常 的甲基化可能是基因沉寂的一个潜在分子通路。虽然DNA甲基化是一个复杂的过程, 还有许多方面没有研究清楚, 但我们相信随着对这一领域的不断研究, 对于阐明肿瘤的发生机制, 从而采取相应措施对肿瘤进行早期预 防、 早期诊治以及正确评估预后等都会有重要作用。4? 参考文献1?Da mmann R, L iC, Yoon JH,et a. l Epigenetic inactiva ?tion of a RAS association do main fa m ily protein from thelung tumour suppressor locus 3p21. 3 J.Na
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13、RASSF1 A) inmalignant cutaneoumelanoma J. CancerRes , 2003, 63: 1639?1643 .4?Schagdarsurengin U, G i mm O, Hoang?Vu C,et a.l Fre ?quent epigenetic silencing of the CpGisland promoter ofRASSF1A in thyroid carcinoma J. Cancer Res, 2002, 62 :3698?3701 .5? Kuzmin I , L iu L, Dammann R,et a. lInactivatio
14、n of RASassociation do main fam ily 1A gene in cervical carcinomasand the role of human papillo mavirus infection J. CancerRes , 2003, 63: 1888?1893 .6? Agathanggelou A, CooperW N, Latif F . Role of the Ras?association do main fa m ily 1 tumor suppressor gene in humancancers J. CancerRes ,2005 , 65:
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