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1、中山大学博士学位论文骨髓间质干细胞定向诱导分化与移植治疗DMD模型鼠的研究姓名：李中申请学位级别：博士专业：神经病学指导教师：张成2003.4.28! ! 苎望苎三竺苎查皇堡兰坌鱼皇堡苎堕堕婴竺苎型塾竺竺查一一1 2 坚骨髓间质千细胞定向诱导分化与移植治疗I ) M D 模型鼠的研究专业：神经病学博士生：李中导师：张成教授中山大学附属第一医院神经科，中国广州( 5 1 0 0 8 0 )摘要f D u c h e n n e 型肌营养不良症( D u c h e n n em u s c u l a rd y s l r o p h y ，D M D ) 是种原 发于骨骼肌组织的致死性X -
2、连锁隐性遗传性疾病，发病率为神经系统单基因遗传瘸的首位，以进行性肢体近端肌萎缩、无力，伴腓肠肌、三角肌等处假性肥大为舆型临床症状。病因主要是由于x 染色体短臂2 区1 带( X p 2 1 ) 的基因突变而导致一种细胞骨架蛋白抗肌萎缩蛋白( 曲s l r o p h i n ，d y s ) 缺乏所致，其病程进展快，预后差，多于2 0 3 0 岁因呼吸衰竭和心力衰竭而死亡。近年来，D M D 的基因诊断已为临床广泛应用，但尚无有效治疗方法。目前，任何药物的治疗都不能终止D M D 进行性肌损害进程：基因治疗又因存在一定的抗原性与致瘤性，以及表达效率低，不能携带全长抗肌萎缩蛋白基因等问题而仅用于
3、实验研究；成肌细胞穆植虽在病肌中能检测到抗肌萎缩蛋自表达和有一定的肌力改善，但效果仅局限在注射部位，不能根本解决心肌损害与膈肌无力所导致的心力和呼吸衰竭，因而I 晦床应用价值不大。1 9 9 9 年，G u s s o n i 等用骨髓造血干细胞通过静脉移植治疗国际公认的一种肌营养不良鼠模型m 出鼠获得成功，使骨髓干细胞移植成为治疗D M D 及其它肌萎缩症的一条新途径。但是，造血干细胞移植需进行大剂量放疗以消除受体对植入细胞的免疫排斥反应，并使宿主骨髓细胞龛腾空以利于外源细胞的植入，垒：塞：曼查苎。堡兰垒垒叁圭苎兰而放疗的结果可产生急慢性放射病或移植物抗宿主病等严重并发症，临床应用有一定风险
4、。骨髓中还存在具有能分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞等多种中胚层来源问质细胞的多潜能非造血干细胞骨髓问质干细胞( m e s e n c h y m a ls t e mc e l l s ，M S C ) 。M S C 携带机体全都基因组，体内分布范围广，可通过静脉移植掺入受损组织进行分化与修复，是细胞治疗与组织工程的理想载体：体外培养可长期保持未分化表型而不断增殖，由于不表达主要组织相容性复合物M H CI 和I I 类抗原与共刺激因子，故属免疫缺陷细胞，不引起T 淋巴细胞的识别与j 免疫排斥反应( 或程度很轻) ，具有异体移植的可能”目前，M S C 定向诱导分化为肌细胞的条件以
5、及在病变肌组织中保持自身稳定和参与修复的机制还不清楚，亦无运用M S C 移植治疗肌营养不良理想动物模型的l 晦床实验资料。因此，本研究设计建立体外分离、纯化、鉴定、扩增人与鼠M S C 的培养体系，运用不同培养条件观察对细胞传代、增殖的影响，明确其生物学特性；运用联合化合药物法诱导M S C 定向分化为肌样细胞，并对分化后的细胞进行肌特异性标记物的免疫组化检测与超微结构观察，探讨可能的分化调控机制；运用微量血D N A 对D I V I D 动物模型子代鼠进行快捷准确的基因型鉴定；对鉴定的动物模型m d x 鼠与d k o 鼠分别进行尾静脉异基因M S C 移植治疗，建立动物细胞静脉移植的技
6、术模式；在移植后的不同时间段检测动物肌组织d y s t r o p h i n 与u t r o p h i n 的表达以及病理学与超微结构的观察，并对动物的行为学与运动功能进行观察比较，以评价细胞移植后对受损肌组织修复与再生的作用，探讨疾病异基因移植治疗的途径，为临床应用提供理论基础与实验依据。1 材料与方法1 1 实骏材料1 1 1 骨髓问质千细胞鼠骨髓间质干细胞( r M S C ) 取自S D 鼠的股骨与胫骨骨髓：人骨髓问质千细胞( h M S C ) 取自支气管扩张手术摘除的肋骨骨髓。1 1 2 实验动物实验组分r M S C 组与h M S C 组，其中，6 周龄m d x 鼠各
7、1 6 只，对照组8 只：6 周龄d k o 鼠各8 只，对照组4 只。骨髓问质干知胞定向诱导分化与移植治疗D M D 模型囊的研究中文摘要1 1 3 试剂与器材( 略)1 2 细胞实验方法1 2 1 主要试剂与溶液的配制( 略)1 2 2 人和鼠M S C 的培养、传代与鉴定用含2 0 胎牛血清( F B S ) 的D F 完全培养液将分离得到的M S C 细胞密度调整至1 1 0 6 m l ，接种子培养瓶并置5 C O ：、3 7 “ C 、饱和湿度的二氧化碳培养箱中原代培养，三天换液一次。贴壁细胞接近8 0 0 , 4 - - 9 0 融合时，O2 5 胰酶消化，用含1 5 F B S
8、 的培养液悬浮沉淀细胞，将细胞悬液以l ：3 接种传代。胰酶消化P 6 代细胞，荧光抗体标记，流式细胞仪检测细胞表面抗原表达。1 2 3M s c 的基本生物学特性观察取生长良好的培养细胞，噻唑蓝( M T T ) 比色法测定并绘制细胞生长曲线和分裂指数曲线。结晶紫染色，光镜下计算细胞克隆形成率。1 2 4 不同培养条件对M S ( 2 生长、增殖的影响分别运用H - D M E M 、L - D M E M 、D F 及R P M l l 6 4 0 四种不同培养液和含5、1 0 、1 5 和2 0 体积分数F B S 的D F 培养液以及0 1 、O 5 、1 0 、2 0 、4 0 、6
9、 0 、8 0 、1 0 0 ( 1 0 4 m ) 的细胞接种密度等不同培养条件观察对M S C 生长、增殖的影响。1 2 5 诱导分化为肌样细胞的S A B C 免疫组化染色检测用5 鸭儿的b F G F 预诱导尸6 代M S C ，2 4 h 后更换培养液，分别用含1 0 9 m o l L +0 2 5 m g L 、3 0 1 a n o l L + 0 5 0 m g L 、5 0 I t m o l L + 07 5m g L 、7 0 l x m o l L + 10 m g L 、1 0 9 r a o l L + 1 2 m g L 、1 2 l x m o l L + 1
10、 5 m g ，L 、1 5 p m o l L + 2 0 m g L 的5 - a z a c y t i d i n e 和a m p h o t e r i c i nB 组合液的含1 5 F B SD F 完全培养液各自依次处理2 4 h 后，0 0 1 MP B S 洗涤并更换为添加5 H S 、1 2 5 烬几V i t C 、l 鹇LD e x a r n e t h a s o n e 、0 , 2 5 U m lI n s u l i n 的D F 完全培养液继续培养，对照组只用D F 培养液换液。诱导分化2 0 d的M S C 细胞爬片做d e s m i n 和m y
11、o g l o b i n 免疫组化S A B C 染色检测。1 2 6 诱导分化前后的电镶超徽结构观察取P 2 代和诱导分化2 0 d 的P 6 代M S C ，经固定、脱水、包埋、切片、染色处理后，透射电镜观察。垒：塞竺盎! ：堡兰垒垒查! 查苎圭1 。3 动物移植方法1 3 1D b l D 模型鼠基因型鉴定试剂盒抽提微量血基因组D N A ；序列特异性引物- P C R 扩增，反应条件为：9 4 。C 预变性3 m i n 一9 4 “ C 变性3 0 s e c 一5 6 5 “ C 退火3 0 s e c 一7 2 “ C 延伸3 0 s e c ( 3 5个循环) 一最后7 2
12、“ C 延伸l O m i n ；1 8 ( w v ) 琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，D N A 测序验证。1 3 2D b l D 模型鼠的M S C 移植治疗取P 5 代对数生长期的M S C ，常规胰酶消化，基础培养液调整细胞密度为lX1 0 6 m l ，实验鼠以O 3 m l 只的液体量经尾静脉缓慢注射移植，对照鼠仅注射无细胞的等量基础培养液。1 3 3 移植后模型鼠肌组织病理学、免疫荧光及电镱检测移植后1 5 w 模型鼠的腓肠肌组织冰冻切片H E 染色，显微镜下计算核中移纤维数百分比；S A B C - C y 3 免疫荧光检测a y s t r o p l l i n 、u t
13、r o p h i n 并做图像分析处理，计算阳性纡维的平均光密度；电镜观察肌组织的超微结构变化。1 3 4 移植后模型鼠的行为与运动功能观察移植后1 5 w 的实验鼠与对照鼠分别进行牵引、转棒、转轮、倒挂、翻身、走步的运动功能实验，录像记录实验内容。1 4 统计学处理采用方差分析，使用社会科学统计软件包S P S S1 00f o rW i n d o w s 对数据资料进行统计检验。2 实验结果2 1M S C 的基本生物学特性M S C 原代接种2 4 h 后8 0 以上贴壁，3 d 后增殖明显，5 7 d 可见细胞集落，1 2 1 4 d9 0 以上细胞趋于融合，多数呈均一、典型的“纺
14、锤状”成纤维细胞样形态。传代细胞6 8 h 可贴壁、伸展成梭形细胞，2 4 h 后开始增殖，细胞集落增多，1 0 d 后又可传代，体外每传一代，细胞数量可增加近2 5 倍，经3 代以上的M S C 趋于纯化。人鼠M S C 生长特点大体类似。经流式细胞仪检测，体外培养传代贴壁生长的M S C 均一性好，仅表达间质类干细胞的特征性表面标记抗原。! ! 苎苎堕! 竺苎奎皇堡量坌鱼皇竺苎苎堕竺竺苎竺苎竺曼查一j 2 坠培养细胞在原代接种后1 2 d 为生长潜伏期，3 6 d 进入对数生长期，倍增时间约4 8 h ，以后逐渐进入平台期；传代后细胞生长潜伏期约1 2 2 4 h ，4 8 h 后可进入对
15、数生长期。2 2 不同培养条件对M S C 生长的影响接种于L - D M E M 与D F 两种培养液中的细胞形态均一，生长融合增殖情况良好，而接种于R P M l l 6 4 0 与H - D M E M 培养液的细胞均不利于生长增殖。含2 0 体积分数F B S 的培养基对细胞原代培养好，传代后则以1 0 1 5 体积分数F B S的为好。2 3M S C 诱导分化为肌样细胞的免疫组化检测诱导l O d 后可见部分细胞变成多角形状，2 0 d 后可见趋于融合的多核肌管样细胞结构。其中，3 1 1 m o l L + 0 5 m g L 、5 t x m o l L + 07 5 m g
16、L 和7 1 t m o l L + l m g L 的5 -氮杂胞苷与两性霉素B 组合处理后，镜下肌管形成比分别为1 1 0 、25 1 0 和3 1 0 。经d e s m i n 和m y o g l o b i n 免疫组化S A B C 染色检测，9 0 以上胞浆呈棕黄色阳性反应。其余组合剂量均未诱导成功。2 4M S C 诱导分化前后的超徽结构| P 2 代M S C 在透射电镜下主要有巨噬样、内皮样和成纤维样三种基本形态结构，而P 6 代M S C 则以成纤维样细胞为主，总体表现为早期幼稚细胞发育的特点。经诱导分化的肌样细胞有丰富的糖原和核糖体，胞浆靠胞膜边缘可见无细胞器的条状肌丝区带。2 5D M D 动物模型的基因型鉴定共鉴定子代鼠1 1 2 只( 雄性2 8 只，
