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1、美国俄亥俄州立大学研发出一种 “纳米美国俄亥俄州立大学研发出一种 “纳米 RNA 颗粒” ，为囊泡穿上“肿瘤探测外衣” ，实现颗粒” ，为囊泡穿上“肿瘤探测外衣” ，实现 高效特异的分子递送高效特异的分子递送 原创 2017-12-13 订阅号 APExBIO 研究意义 利用天然的siRNA载体如细胞外囊泡将siRNA递送至受体细胞来实现特定基因的 沉默， 一时引起了一片研究热潮， 因为载体的利用避免了裸 siRNA 被核酶 （RNase） 降解使 siRNA 被完整地送入靶细胞，很大程度上提高了治疗效果。然而，近几年 热度降低了很多，因为这种方法面临一个很大的阻碍，那就是天然细胞外囊泡的 靶
2、向性并不好，导致分子的递送效率不高。近日，来自美国俄亥俄州立大学哥伦 布分校的研究团队利用 RNA 纳米技术制成了一种 RNA 纳米颗粒， 这种颗粒形似箭 头，含有 RNA 适体或叶酸（即特定的配体），控制箭头的方向可以使这些配体在 细胞外囊泡的外面表上展示，得到“配体-展示细胞外囊泡”。细胞外囊泡外表 面的配体能够与受体细胞进行特异性结合， 因而能够将囊泡内的 siRNA 特异性并 高效地递送至靶细胞，导致靶基因的沉默。这种配体-展示细胞外囊泡可以有效 地阻断三种癌症模型中的肿瘤生长，包括前列腺癌、乳腺癌和结直肠癌。 RNA 纳米技术是一个新兴领域, 利用纳米技术制成的 RNA 纳米颗粒可载
3、入沉默基因的小干扰 RNA，调控基因表达的 micro-RNA，靶向癌细胞的核酸适体，或能够催化化学反应的核酶，从而更直接更有效地靶向癌症转移灶。 噬菌体 phi29 马达包装 RNA（bacteriophage phi29 motor packaging RNA）的三路连接（3WJ，three-way junction）可以根据自身固有的性质折叠成螺旋区域之间呈 60、120、180三个角度的平面结构（图 1）。 图 1 a，pRNA-3WJ 的原子力显微镜（AFM）图像；b，3WJ 箭头或箭头的胆固醇标记位置示意图。 通过掺入 RNA 适体（RNA aptamer，作为靶向配体），将 pR
4、NA-3WJ 延伸成箭头状结构， 以结合癌细胞中过度表达的特异性受体。 工程化的 pRNA-3WJ 用于修饰从 HEK293T 细胞培养上清液中纯化的细胞外囊泡（extracellular vesicles ，EVs）。 细胞外囊泡是指从细胞膜上脱落或者由细胞分泌的双层膜结构的囊泡状小体，直径从 40nm 到 1000nm 不等， 包裹多种 mRNA、 microRNA 等小 RNA、 质粒 DNA、酶和神经递质等，参与细胞间通讯、细胞迁移、血管新生和免疫调节等过程。 一个单一的类固醇分子胆固醇三甘醇 （TEG） 被结合到 pRNA-3WJ 的箭头尾部以促进 3WJ 锚定在 EVs 膜上。胆固
5、醇通过其疏水部分自发地插入 EVs 膜中。通过简单地在 37C 下将胆固醇修饰的 RNA 纳米颗粒与 EVs 一起孵育 1 小时，实现在纯化的 EVs 表面上展示 RNA 纳米颗粒。 EVs 作为治疗载体具有很大的潜力，因为它们在细胞之间的通信中起作用。它们可以通过多种途径进入细胞，包括膜融合，四跨膜蛋白和整联蛋白受体介导的内吞作用，脂质筏介导的内吞作用或微细胞增多。然而，受体细胞的特异性有限。为了特异性靶向癌细胞，将三类靶向配体为了特异性靶向癌细胞，将三类靶向配体叶酸（叶酸（folate，FA）、前列腺特异）、前列腺特异性膜抗原（性膜抗原（PSMA）RNA 适体、表皮生长因子受体（适体、表皮
6、生长因子受体（EGFR）RNA 适体适体连连接到接到 3WJ 以展示在以展示在 EVs 的外表面。的外表面。叶酸是一种有吸引力的靶向配体，因为许多上皮来源的癌症，如结直肠癌，过度表达叶酸受体。PSMA 在前列腺癌细胞中以异常高水平表达，其表达也与更具侵袭性的疾病有关。之前有研究显示在 EVs 上展示的结合 PSMA 并有 2-氟（2F）修饰的 RNA 适体 A9g 可以增强对前列腺癌细胞的靶向效率。EGFR 在三阴性乳腺癌和转移性三阴性乳腺癌中高度过表达。将 EGFR 特异性 2F-RNA 适体并入 pRNA-3WJ 的一端， 从而展示在 EVs 上并增强对乳腺癌细胞的靶向。 Survivin
7、，一种细胞凋亡抑制因子，是肿瘤治疗中很有吸引力的一个靶点，因为它的沉默可以降低致瘤性并抑制肿瘤转移。 将survivin siRNA装载在EVs中 （图2） ，可以评估体内前列腺癌，乳腺癌和结肠癌抑制的功效。为了提高 siRNA 在体内的稳定性，过客链（passenger strand）的嘧啶上进行了 2F 修饰以提供 RNA 酶抗性，而引导链（guide strand）未被修饰。 图 2 EVs 负载和 RNA 适体展示 通过控制箭头状pRNA-3WJ纳米结构的方向和角度来控制EVs的RNA载入或表面展示。箭尾上的胆固醇促进了箭尾上的胆固醇促进了 EVs 表面上的表面上的 FA-3WJ 或或
8、 RNA 适体的展示适体的展示，即将RNA纳米颗粒锚定在 EVs膜上。 在箭尾中， 60角的两个臂可以充当钩将 RNA纳米颗粒锁定，这种效应将阻止钩状 RNA 通过膜（图 3）。而箭头上的胆固醇促进了RNA纳米颗粒进入EVs。 尽管EVs进入受体细胞的自然过程不依赖于配体，但是尾部胆固醇 RNA-3WJ 使 EVs 表面展示配体并增加了 EVs 靶向相应受体的效率。 图 3 箭尾和箭头展示的区别 特定的癌细胞靶向是将纳米囊泡应用于癌症治疗的先决条件。为了产生癌细胞靶向 EVs，科学家们已经探索了很多在 EVs 上表达癌细胞特异性配体的方法。如过表达与EVs膜蛋白融合的肽配体： 对神经元乙酰胆碱
9、受体特异性的肽RVG与EVs膜蛋白 Lamp2b 融合，在树突状细胞上过表达；作为 EGFR 配体的 GE11 肽融合到血小板源性生长因子受体的跨膜结构域上， 以在 HEK293T 细胞上过表达等等，这些都存在一个问题， 那就是在 EVs 生物发生过程中所展示的融合肽可能会被降解。在这里，作者在生物发生后的 EVs 表面展示配体，以增强其特异性。 通过尾静脉注射方式进行 FA-3WJ / EVs 全身给药至 KB 细胞 （FA 过表达细胞） ，构建皮下异种移植小鼠模型。 3WJ / EVs（无靶向配体）和 PBS 处理的小鼠作为对照。8 小时后 FA-3WJ / EVs 主要积累在肿瘤中，与
10、PBS 对照小鼠相比，在在重要器官中积累较少重要器官中积累较少， 并且与3WJ/ EVs 对照小鼠相比在肿瘤中积累更多肿瘤中积累更多 （图4） 。说明 FA-3WJ / EVs 高效靶向肿瘤而不是重要器官。 图 4 叶酸展示 EVs 特定靶向肿瘤 PSMA-适体适体-展示展示 EVs（PSMAapt / EVs）完全抑制小鼠前列腺癌的生长。）完全抑制小鼠前列腺癌的生长。用PSMAapt/ EVs/Survivin siRNA（siSurvivin）处理小鼠，每 3 天一次，与对照组相比，完全抑制了小鼠体内肿瘤生长。处理后 40 天从小鼠体重可以看出没有观察到任何显著的毒性。 采用PCR技术分析
11、肿瘤组织中Survivin mRNA的表达水平，显示 PSMAapt / EVs/ siSurvivin 沉默了 survivin（图 5）。说明 PSMA-适体-展示EVs 是体内递送survivin siRNA 的高效载体， 全身注射 PSMAapt / EVs / siSurvivin可能实现期望的强大治疗功效。 图 5 PSMA-适体-展示 EVs 完全抑制小鼠前列腺癌的生长 EGFR-适体适体-展示展示 EVs 抑制小鼠中的乳腺癌生长。抑制小鼠中的乳腺癌生长。EGFR 在乳腺癌细胞中的高表达与接受治疗患者的高增殖和复发风险相关。作者构建了携带 EGFR 适体的pRNA-3WJ 纳米粒
12、子，用于在 EVs 表面展示，并且 EVs 载有 survivin siRNA。通过尾静脉将EGFRapt / EVs / siSurvivin颗粒给予携带MDA-MB-468原位异种移植肿瘤的小鼠。用 3WJ / EVs / siSurvivin（无靶向配体）或 PBS 处理的小鼠用作对照。 8小时后 EGFRapt / EVs / siSurvivin在肿瘤中的累积量高于对照组 （图6） ，表明在 EVs 表面上展示的 EGFR 适体大大提高了其在体内的肿瘤靶向能力。同样通过 western 印迹和 PCR 验证了 survivin 的特异性沉默。 结果表明向乳腺肿瘤细胞的 survivi
13、n siRNA 成功递送抑制了蛋白和 mRNA 水平的 survivin 表达。 图 6 EGFR-适体-展示 EVs 抑制小鼠中的乳腺癌生长 叶酸叶酸-展示展示 EVs 抑制小鼠结直肠癌的生长。抑制小鼠结直肠癌的生长。Survivin 基因（一种抗凋亡蛋白）在大多数结肠直肠癌中上调。 作者构建了携带叶酸 （FA） 的 pRNA-3WJ 纳米颗粒，用于在 EVs 表面上展示，并将 EVs 负载 survivin siRNA。然后在临床相关患者衍生的结直肠癌异种移植 （PDX-CRC） 小鼠模型中评估功能化的EVs。 结果FA / EVs / siSurvivin 的处理显著抑制体内肿瘤的生长（
14、图 7）。 数据表明，叶酸-展示 EVs可以用于结直肠癌治疗中递送 siRNA 的载体。 图 7 叶酸-展示 EVs 抑制小鼠结直肠癌的生长 总之，体外应用 RNA 纳米技术生成了具有膜锚定脂质结构域的多功能 RNA 纳米粒子。胆固醇置于 3WJ 的箭头尾部，RNA 配体被阻止运输到 EVs 中，确保定向表面展示用于癌症受体结合的靶向配体。 在 EVs 表面引入箭头状 3WJ-RNA 纳米颗粒不仅为 EVs 提供了靶向配体，而且在在 EVs 表面添加了负电荷表面添加了负电荷，有助于减少EVs 与正常细胞的非特异性结合。 这种靶向配体展示 EVs 可以用于癌症治疗中的高效 siRNA 递送载体。 原始文章： Nanoparticle orientation to control RNA loading and ligand display on extracellular vesicles for cancer regression. Nature Nanotechnology. Published online:11 December 2017.
