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1、北京协和医学院博士学位论文肺癌患者血清EGFR基因突变检测方法的比较姓名：秦岭申请学位级别：博士专业：临床医学指导教师：陆慰萱;王孟昭20090601E G F RT N S C L CD H P L CP C RS D SP K CE I M A P KP 1 3 KP T E NP I P 3I P T GI G F R 1英文缩略语A b b r e v i a t i o ne p i d e r m a lg r o w t hf a c t o rr e c e p t o r表皮生长因子受体t y r o s i n ek i n a s ei n h i b i t o rn
2、o ns m a l lc e l ll u n gc a n c e r酪氨酸激酶抑制剂非小细胞肺癌d e n a t u r i n gh i g hp e r f o r m a n c e变性高效液相色谱l i q u i dc h r o m a t o g r a p h yp 0 1 ) r m e r a s ec h a i nr e a c t i o ns o d i u md o d e c y ls u l f a t ep r o t e i nk i n a s eC聚合酶链反应十二烷基磺酸钠蛋白激酶Ce x t r a c e l l u a rs i g n
3、a l - r e g u l a t e dk i n a s e细胞外调节激酶m i t o g e n - a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e丝裂素原活化蛋白激酶p h o s p h a t i d y i n o s i t o l - 3 - k i n a s e3 磷酸脂酰肌醇激酶p h o s p h a t a s ea n dt e n s i nh o m o l o g磷酸酶及张力蛋白同源分子p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l3 , 4 ，5 - t r i p h o s p
4、 h a t e三磷酸磷脂酰肌醇i s o p r o p y lb e t a - D - t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e异丙基硫代半乳糖苷i n s u l i n - - l i k eg r o w t hf a c t o rr e c e p t o r1胰岛素样生长因子受体12第一部分摘要肺癌患者血清E G F R 基因突变检测方法的比较背景：研究表明肺癌组织的E G F R 基因突变检测可以有效预测E G F R - T K I 类药物的临床疗效，但临床中因肿瘤组织取材困难限制了E G F R 基因突变的检测。研究发现肺癌患者
5、循环血中游离D N A 含量显著高于正常人，并且与原发肿瘤组织具有高度的遗传一致性，因此探索灵敏高效的检测方法对循环血基因组E G F R 基因突变的检测至关重要。目的：比较D H P L C 法、基因测序法和D x sE G F R2 9m u t a t i o n sK i t 法对肺癌患者外周循环血血清的E G F R 外显子1 9 和2 l 基因突变的检测结果，寻找一种准确度高、灵敏性好、操作方便的检测方法。方法：收集晚期肺癌患者血清8 7 份，采用D H P L C 法检测E G F R 外显子1 9 和2 1 基因突变并用测序或克隆测序法验证；同时采用基因测序法对血清的E G F
6、 R 外显子1 9 和2 1的基因突变进行检测。收集周南等采用D x sE G F R2 9m u t a t i o n sK i t 法检测E G F R基因突变的血清4 9 份，同时采用D H P L C 法和基因测序法检测E G F R 外显子1 9 和2 1的基因突变。应用S P S S l 3 0 软件，卡方检验分析三种方法对E G F R 突变检出率的差异。结果：采用D H P L C 法和基因测序法检测8 7 例晚期肺癌患者血清的E G F R 外显子1 9 和2 1 基因突变，D H P L C 法的突变率3 5 6 3 ( 3 1 8 7 ) 较测序法的突变率4 5 9 (
7、 4 8 7 )高，且具有统计学差异( P 0 0 5 ) T h em u t a t i o nr a t eo fa d e n o c a r c i n o m aW a sh i g e rt h a no t h e rt y p e so fl u n gC a n C e r I nb e n i g nd i s e a s e sa n de a r l y - s t a g el u n gc a n c e rp a t i e n t s s e r u ms a m p l e s ，m u t a t i o n so fE G F Rw e r en o t
8、f o u n db yD H P L C ，g e n es e q u e n c i n go rD x sE G F R2 9m u t a t i o n sK i t C o n c l u s i o n s ：C o m p a r i n gw i t l lg e n es e q u e n c i n g , D H P L Cc o u l ds e r v ea sab e t t e rp r e l i m i n a r ys c r e e n i n g m e t h o df o rE G F Rg e n em u t a t i o n si na
9、 d v a n c e dl u n gc a n c e rp a t i e n t s s e r u ms a m p l e s D u et ot h el o wp e r c e n t a g eo fs e r u mm u t a n tD N A ，n oE G F Rm u t a t i o nW a sf o u n db yt h et h r e e m e t h o d sa b o v ei ne a r l y - s t a g el u n gC a n C e rp a t i e n t s s e r u m S o ，am o r es
10、e n s i t i v em e t h o di sn e e d e df o re a r l y - s t a g el u n gc a n c e l “ p a t i e n t s K e yw o r d s ： L u n gc a n c e r ；s e r u m ；E G F Rg e n em u t a t i o n ；m e t h o d ；c o m p a r i s i o n5引言肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，在很多发达国家中其发病率在男性恶性肿瘤中居首位，我国肺癌患者的病死率居所有恶性肿瘤首位，且发病率呈逐年上升趋势。尽管近年来靶向治
11、疗技术有了很大的提高，但患者的治愈率和5 年生存率仍然很低，相关研究表明低治愈率与诊断不及时或未发现早期阶段的微转移n 2 1 有关，但目前临床应用的检查手段如胸片、C T 、痰脱落细胞学检查、纤维支气管镜等，对肺癌早期诊断和早期微转移的发现价值有限。与其他肿瘤一样，肺癌的基因改变往往早于组织的病理学改变，肺癌的发生为多基因参与的多阶段过程，涉及抑癌基因失活、原癌基因的活化以及基因突变，其中K - r a s 和表皮生长因子受体( e p i d e r m a lg r o w t hf a c t o rr e c e p t o r ，E G F R ) 基因突变备受关注1 ，有望成为肺
12、癌早期诊断、靶向治疗、复发以及判断预后的重要生物标记。E G F R 是一种分子量为1 7 0 K D 的跨膜糖蛋白，分布于细胞膜表面，属于H E R 家族的成员，其结构包括3 个主要部分：细胞外配体结合域、跨膜域和胞内域，胞内域具有酪氨酸激酶活性，酪氨酸激酶功能区具有3 个重要结构：氨基端小叶、Q 螺旋结构、羧基端小叶。当E G F R 与其配体结合后，可在细胞表面形成同源或者异源二聚体，二聚体内陷，胞内酪氨酸激酶域发生自身磷酸化，磷酸化的酪氨酸残基可作为细胞内信号传导和调节分子的结合位点激活其下游的多个信号传导通路，包括P 1 3 一A K T 、R a s R a f - M E K M
13、 A P K 、J A K S T A T ，从而参与调节多种生物学效应，包括基因表达、细胞增殖、血管生成、抗凋亡等口1 。E G F R 的过度表达导致大量信号产生，引起下游信号传导通路的激活，使得细胞过度生长和具有侵袭性，在非小细胞肺癌中根据组织学类型的不同，E G F R 过表达率波动在4 0 - - - 8 0 。E G F R 上述特点使其成为靶向治疗的热点。针对E G F R 的药物主要有两类：( 1 ) 单克隆抗体，直接作用于E G F R 细胞外配体结合域；( 2 ) 小分子化合物，抑制E G F R 细胞内酪氨酸激酶域活性，如G e f i t i n i b 、E r o
14、l t i n i b 等。P a e z 嘲和L y n c h 四1 等的研究显示E G F R 基因突变同G e f i t i n i b 的疗效密切相关。这些基因突变集中在编码E G F R 酪氨酸激酶结构域的1 8 - 2 1 外显子上，突变类型主要为替代突变和缺失突变。P a z e 等随1 的研究还发现E G F R 基因突变与病人特点密切相关，腺癌的E G F R 突变多于其他类型的非小细胞肺癌、女性病人的E G F R突变多于男性病人。L y n c h 等3 的研究亦表明突变多见于女性、腺癌以及非吸烟者。关于亚洲病人的靶向药物临床研究显示G e f i t i n i b
15、 与安慰剂组相比可延长生存期，6I D E L I & 2 研究显示不同基因突变的病人对G e f i t i n i b 的反应与临床相符。因此，非小细胞肺癌患者的E G F R 酪氨酸激酶结构域的基因突变可成为预测患者对E G F R 酪氨酸激酶抑制剂是否有效的分子标记物。目前，人们已经对肺癌患者手术切除组织、痰液、鼻咽分泌物、支气管镜的肺泡灌洗、肺活检组织等的K r a s 基因和E G F R 基因的突变情况进行了较为详尽的研究，但以往的研究中常因取材的限制，导致基因突变的检测受到严重限制。手术切除组织作为研究材料固然准确可靠，但肺癌早期的患者不列入靶向治疗的范围，晚期患者就诊时大多失
16、去了手术机会，因此利用手术切除组织检测基因突变难以成为临床中的常规检查方法。近6 0 年来，研究证明正常人、良性疾病患者以及恶性肿瘤患者的外周循环血中存在微量的D N A n ，其中正常人以及良性疾病患者循环血中的核酸主要来源于自身的淋巴细胞n 引，而恶性肿瘤患者循环血中的核酸除少部分由淋巴细胞释放产生外，大部分来源n 3 1 4 1 于原发灶肿瘤细胞的凋亡坏死或转移过程中循环血中瘤细胞的裂解释放。早在2 0 世纪7 0 年代S A L e o n 等n 纠力报道恶性肿瘤患者尤其是转移癌患者血浆中D N A 或R N A 含量常明显增加，且其含量的高低与治疗疗效相关。此后，许多研究应用不同的检测方法对肿瘤患者外周血中的核酸进行定量分析，发现循环血D N A 定量分析不仅在肿瘤的早期诊断中具有重要意义，而且是疗效评价及随访的重要生物学指标n 引。此外，分子生物学研究证实血液中的游离D N A 与原发肿瘤的基因组D N A 具有相同的遗传变异啪1 。上述现象提示分析血液游离D N A 可以替代组织成为检测肿瘤基因突变的新
