《氟非尼酮对细胞色素p450活性的影响研究曹亚杰》由会员分享，可在线阅读，更多相关《氟非尼酮对细胞色素p450活性的影响研究曹亚杰（73页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、分类 号U D C编 号中 南 大 母C E N T R A L S O U T H U N IV E R S IT Y硕 士 学位 论 文论文题目:氟非尼酮对细胞色素 P450 活性 的影 响研 究学科 、专业 :研究生 :导 师 姓 名 及 其 专 业 技 术 职 称 :中南大学二 0 0 七 年 五 月分类 号 V D C密级硕 士 学 位 论 文氟非尼酮对 细胞色 素 P 45 0 活性 的影 响研 究E ff e ct o f F lu o ro fe n id o n e o n C y to eh ro m e P 4 5 0 E n zy m eA etivity研究 生 :曹
2、亚杰学科专业 :药剂 学研 究方 向:药物 代谢 机制 研 究学院 :中南 大 学 药 学 院导师 :程 泽 能 教授论 文 答 辩 日 期 答 辩 委 员 会 主 席 些 中南大学二 0 0 七 年 五 月中 南 大 学学 位 论 文 保 密 审 批 表申请 人姓 名所在 学 院学位类 别论 文 题 目建议 密 级龟叭巍音油O争6r 功 0 1博士口硕士澎联 系 电话翰刹尝一 犯 切 。 I，娜县非 角 帆 妓斓私包氰P物 确氰响朴兔 感建 议保 密 期限 1碑定密 依 据 及保 密要 点 :园 家 一 龟氰乳书纵流巍内 鸟， 曳马 位 砧 伶始协录姗 吨艳集峋 毒、 将 “ 伽申 嘱、 、
3、 扑 ， :值 。 公 开 ， 、 :、 终、 、 “ 淆 傅 导 师 签 字 补( 恤学 院审 查(盖章 ):间年石 月 奋日学 校 审 批(盖章 ):口了密 级类 型口了口密密部机秘内日令国家秘 密技 术秘 密专利技 术保 密 期 限保 密 期 拜呀卜 保密期娘一介 一年月 获 岌 ， 探沪 . .之 三翎 宁二匀飞 匕: 月拍 r .， 飞少夕 禽伍;汉公/广 厂r活-， r尹， 公 入 峨 1 心 ，J 歹 、辉人 产， j火气毕 从_ 月、? 俞 了/注: 办理 学位论 文保 密审批手 续 必须携 带全部 学位论 文以便 加盖保 密专用章硕 士学位 论文原创 性 声 明本 人 声 明
4、，所呈 交 的学位 论文 是本 人在 导师指 导下进 行 的研 究 工作及取得 的研 究成果 。尽我所知 ，除 了论文 中特 别加 以标注和致谢 的地 方外 ，论文 中不包 括 其他 人 已经 发表 或撰 写过 的研 究成 果 ，也 不 包含 获得 中南大 学或其他 单位 的学位 或 证 书而 使 用 过 的材料 。与我共 同工作 的 同志对本研 究所作 的贡献均 己在本论文 中作 了明确 的说 明。作者签名 :龟丘 么日期:) aD7年 月f日关于学位论文使用授权说 明本 人 了解 中南大 学有 关保 留 、使用 学位 论 文 的规 定 ，即 : 学校 有权 保 留学位 论 文 ，允许 学位
5、 论 文被 查 阅和 借 阅 ; 学校 可 以公布 学位 论文 的全 部 或部分 内容 ，可 以采用 复 印、缩 影或其他手 段保存 学位 论 文 ;学校 可根 据 国家 或湖 南 省有 关部 门规 定送 交 学位 论 文 。作 者 签 名 :龟吞 杰 导 师 签 名 :和 右 火 日 期 : 、 2 年 . 兰一 月二. 沪尸硕 士学位论文中文摘要氟非尼酮对细胞色素 p45o 活性的影响研究摘 要、 目的研 究氟 非尼 酮对 细 胞 色 素 P450亚家 族 : C Y P IA 2 ，C Y PZC g ，C Y PZC 19，C Y PZD 6 ，C Y PZE I 和 C Y P3A
6、活 性 的影 响 ，为氟非尼酮 的 药 理 研 究及 临床 药 动 学研 究 以及 预 测 临床 药 物 相 互 作 用研 究提 供 参考 。二 、方 法1.体 外实验方法获取大 鼠及人肝脏标本 后， 以差速离心法制备肝微粒体 ，用卡马斯亮兰法进行蛋 白定量 。 在37 的水浴 中建立肝 微粒体孵 育体系， 加入药动学 实验证 明为有 效剂 量 的一系列浓度 的氟 非尼酮和相 应 的 C Y P 的探针药物进行孵育 。分别 以咖啡 因、咪哒哇仑 、 甲苯磺 丁脉 、氯哇沙 宗 、美托 洛 尔 、美芬妥 因为探 针 药 ，探 测加 入 氟 非尼 酮 组和 未加氟非尼 酮组 C Y P IA 2
7、、C Y P 3A 4 、C Y PZC g、C Y PZE I、C Y PZD 6 、C Y PZC 19 的活性 。2 . 体 内实验 方法按 照 随机 对 照 的原 则 ，32 只 大 鼠雌雄 各 半 ，性 别 内各 随机 分成 4对 ，然 后 性 别 间随机 组 合 成 4 组 ，每 组 8 只 大 鼠，一 组做 对 照 ，另三组分别给予 250 ，50 0 ，100 Om 叭 留day (每天 两 次 ) 氟 非尼酮 的混悬 剂 ，连续灌 胃给药 5 日，处死动 物 ，制备肝 微粒 体 。分别 以咖啡 因、咪哒哇仑 、甲苯磺 丁脉 、氯 哩沙 宗 、异 哇肌 、美芬 妥 因 为探 针
8、 药，测 定大 鼠C Y P 1 A Z 、C Y P 3A 4 、C Y P ZC g 、C Y P ZE I、C Y P ZD 6 、C Y P ZC 19 的活 性 。并 采 用W 七 ster n 一 blot 方 法 对 活 性 有 显 著 改变 的酶 进 行 蛋 白表 达 半 定 量分 析 。三 、结果1. 体 外 实验 部 分户硕 士学位 论 文中文摘要在大 鼠肝微粒体 中加入氟非尼酮 ，发现对 C Y PZC 19、C Y PZC g 和C Y PZE I 有抑制作用 ， 而人肝微粒 体 中加入氟非尼酮后未 发现 明显 的抑 制作用 。2. 体 内实验部分与安慰剂组相 比，氟非
9、尼酮 25 0 m g kg 一 day 一 组 导致 氯 哩沙 宗代谢物产率增加 了约 723 % ，甲苯磺丁脉代谢物产率增加 了约 142 % ，咪哒哇仑代谢物产率增加 了约 129 % ; 氟非尼酮 500 m g kg 一 day 一 组导致氯 哇沙 宗代谢物产率增加 了约 14 倍 ，甲苯磺 丁脉代谢物 产 率增加 了约52% ， 咪哒哇仑代谢物 产率增 加 了约 23 2% ; 氟非尼酮 1000 m g kg 一 day一 组 导致氯 哩沙宗代谢物产率增加 了约 12 倍 ， 甲苯磺 丁脉 代谢物产 率 增加 了约 74% ，咪哒哩仑代谢物产率增加 了约 85 % ; 经统计 分
10、析 ，C Y PZE I 活性 (氯 哇沙 宗代谢物 产率 ) 显著增 加(P 99 3 % )，咖啡 因、1，7一 二 甲基黄 嗓吟 (17X )、 p 一 轻基 乙基茶碱 、1一 经基 咪哒 哇仑 、 甲苯磺 丁脉 、4一 轻 基 甲苯 磺 丁脉 、苯 巴比妥 、6一 轻 基 氯 哇沙 宗 、异哇肌 、尼泊金 乙酷 4一 轻基异哇肌 、美芬妥 因、4一 轻基美芬妥 因、非那西丁 、氯氮卓 、 葡萄糖一 6一 磷酸 (G 一 6一 P )、 葡萄糖一 6一 磷酸脱氢 酶 (G 一 6一 PD H )、 辅酶 n ( p 一 N A D P )、小牛血 清 白蛋 白 (B SA ) 均购 自
11、51脚 a 公 司(St.L ouis， M o， u s )。氯 哇沙 宗购 自sigm a 公 司( l面 eh C hem ie G m b H形edstr，G erm 娜)。 咪 哒 哇 仑 购 自 EH 。 任 由aI m 一 L a Ro che Ltd。乙睛 、 甲醇为色谱 纯 ，其他试剂均 为分析纯 ，水 为重蒸馏 水 。1.2 仪 器B eeki n an OP tim a L E 一 soK 超 高速 离 心器(B eclQ n an ，U SA )，T G L 一 16L M台式高速冷冻离心机 (长沙英泰仪器有 限公司 )，T D Z 4一 W S 低速 台式离心机 (长
12、沙湘仪离心机仪器有 限公司 )， V A L EL U T SP S 24 固相萃取装置 (北京 ， 中国)， PH S一 3C数显型酸度仪 (上海宇隆仪器有 限公司 )，岛津 201OC H T 及 201 0A H T 型高效液相色谱仪 (shim adzu， JaPan )，D Y 89一 11型 电动 玻璃匀浆机 (宁波新芝生物科技股份有 限公 司 )，Sar t ori uos一 B S224s 万 分 之 一 电子 天 平 (北 京 赛 利 多斯 仪器 系 统有 限公 司 ); SH A N G PIN G 刁八 2 003N型 千 分 之 一 电子 天 平(上 海 精 密 科 学
13、仪 器 有 限公司天 平 仪 器 厂 ); K Q 一25OE 型 超 声波 清 洗 器( 昆山市 超 声 仪 器 有 限 公 司 )。1.3 实验 动物SD 大 鼠，20 肚 20 9， 中南大 学 实验 动 物 学部提供 ，许 可证 号 : SC x K(湘 )2006一 0002 。许 可 证 号 : SC X K(湘 ) 2006一 0002 。2 试 验 方 法2.1 肝微粒体反应体 系2.1 .1 肝脏标本 的收集本 实验 所 用 人 肝 脏 标 本 为部 分 肝 切 除术 患 者 的肝 组 织 ，年 龄 在 37一47 岁之间 ，并 要 求 提 供 者 无 急 、慢 性 肝 炎
14、、肝 硬 化 等 疾 病 ，且 手 术 前三 周 未服 用 能够 诱硕 士学位论文体外 实验导或抑制 C 钟 酶活性的药物 。 肝脏标本的收集和使用获得 中南大学伦理委员会 的批准 。肝 叶离体后迅速取其 肉眼相对正常 的肝脏组织放 入冰水 中，立 即被切成 小碎 片 ，冰盐水洗涤数遍之后 ，液氮快速冷冻 30 分钟 ，一80保存 ，用于制备肝微粒体 。本实验 中所用的大 鼠肝标本为健康成年 SD大 鼠，实验前晚禁食 24 小时，实验当天将动物处死 ，取 出肝脏，按如下步骤操作。2.1 .2 肝微粒体 的制备 2 (l) 在冰上将肝标本用剪刀剪成细小块 ; (2) 用冰冷 的生理盐水快速洗涤
15、;(3 ) 用 o. 25m o比 蔗糖液制成 20%(w 刃 ) 的匀浆 ;(4 ) 16， oooxg 离心上层清液 15 分钟 ;(7)小心移 出上层 的清液，不要吸入沉淀物 ;(8 ) 100， 000x g 离心上层清 液 1 小 时 ;(9)弃去上层清 液，将沉 淀物 悬浮 于匀浆 缓 冲液(pH 7.4 T M s缓冲液 ) 中;(10) 100 ， o00x g 离心 已悬浮 的沉 淀物 1 小时 ;(11) 弃去上层清液 ，沥干管 内残存 的液体 ;(12 ) 微粒体沉淀物用液氮 冰冻并在 一70 下存放 。所有操 作在 O 一 4 下进行 。2.1 .2 肝微粒体蛋 白含量
16、的测定蛋白浓度测定原理依据考马斯亮兰法方法 l3 。取牛血清 白蛋白标准溶液(l. om 岁m LL)各 0. 4 ，0. 6 ，0. 8，1. 0 ，1. 2 ，1. 4 ，l. 6mL，加水补足至 2. o mL ，使其 蛋白浓度 分别为 0. 2 ，0. 3 ，0. 4 ，0. 5，0. 6 ，0. 7 ，0. 8 m g/m L ，取 8 只试 管 ，0 号管加入 O.lm L 蒸馏水 ，1一 7 号管分别加入 0.lm L 上述标准液 ，然后加入 sm L 蛋 白染色剂 ，充分振荡混合 ，2而 n 后于 595lu n测 定光 吸收值 ， 以蛋 白浓度 C 对 吸收度 A进行线性 回归 ， 即得标准 曲线方程 :e (林 g 毗 一 ) = 55ol. s A + 1. 4007(: = 0. 999 )。肝微粒体样 品用 T M S 溶液稀释适 当倍数 ，取 0.1 m L 依标准 曲线方法测 定吸收度 ，根 据标准 曲线方程计算 蛋 白浓度 。2.2 孵化反应50 t
