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1、1 1书面实验报告：1 如何判断共聚焦图片的荧光质量？2 影响共聚焦图像质量的硬件因素有哪些 ？请同学们撰写好实验报告后，下次实习前 由各班班长收齐并交给中心负责教学的王老 师处！2 2一一. .概述概述二二. .影响共聚焦检测质量的主要设备参数影响共聚焦检测质量的主要设备参数三三. .因样本的处理不当影响共聚焦检测质量的因样本的处理不当影响共聚焦检测质量的因素因素四四. .样本制作过程需要注意的问题样本制作过程需要注意的问题3 3光电倍增管检测针孔光源针孔光源分色镜物镜样本聚集平面4 4评判荧光样品制备是否有成功，可从以下几个方面考量：1荧光标记反应的特异性和荧光信号定位准确性 2保持样品的
2、结构形态的完整性和免疫活性 3荧光信号的响应准确、灵敏、具有可重复性 4荧光强度 5荧光稳定性 6荧光信号的分布的一致性 7两种及两种以上荧光信号之间荧光光谱交叉，即串色 性 8背景噪声干扰性5 5一一. .概述概述二二. .影响共聚焦检测质量的主要设备参数影响共聚焦检测质量的主要设备参数三三. .样本的处理及影响共聚焦检测质量的因素样本的处理及影响共聚焦检测质量的因素四四. .样本制作过程需要注意的问题样本制作过程需要注意的问题6 6影响获取图像质量主要的共聚焦参数： （1）检测针孔（Detector Pinhole ） （2）激光功率(Power) （3）声光控制器（ AOTF-Acous
3、to Optic Tunable Filter) （4）光电倍增管增益及静噪控制（PMT Gain & PMT Offset ） （5）重复扫描-数字减噪（Li.A.、Aver.） （6）扫描图分辨率（Format）:除此以外物镜（Objective）、 扫描速度（Scan Speed）扫描方向（Unidirectional Scan / Bidirectional Scan）(X-Direction)数码放大（Zoom In） 7 7PinholePinhole检测针孔：默认值检测针孔：默认值=1=1，数值，数值11讯燥比较好讯燥比较好Pin=0.2Pin=1Pin=28 8光电倍增管光电倍
4、增管 PMT PMT PMT gain /PMT ffsetPMT gain /PMT ffset9 9体会值：体会值： 480480 500 Gain 680 500 Gain 680 760760 - 8 - 0 - 8 - 0 OffestOffest + 0 + 2 + 0 + 20255025502551010用线平均法进行线扫描用线平均法进行线扫描用线平均法进行线扫描用线平均法进行线扫描Line Line AversgeAversge的作用是使用平的作用是使用平 均法线扫描的图像，即对每条线进行重复均法线扫描的图像，即对每条线进行重复 多次的扫描，并求每个采样点的算术平均多次的扫描
5、，并求每个采样点的算术平均 值。值。 体会值体会值：常用：常用2 2、4 4，ACCUACCU扫扫 描模式选描模式选4 4、8 8。AversgeAversge的功能是使用平均法的功能是使用平均法 线扫描的图像，即对每张图像进行重复多线扫描的图像，即对每张图像进行重复多 次的扫描，并求每个采样点的算术平均值次的扫描，并求每个采样点的算术平均值 。 体会值体会值：常用：常用2 2、4 4。Li.A=0 Aver=0Li.A=0 Aver=0Li.A=2 Aver=2Li.A=2 Aver=01111单向、双向扫描单向、双向扫描功能：如果点击功能：如果点击UnidirectionalUnidire
6、ctional、Bidirectional ScanBidirectional Scan按钮，会启动按钮，会启动 双向扫描模式，如果不点击此按钮，就默认单项扫描模式双向扫描模式，如果不点击此按钮，就默认单项扫描模式单向扫描双向扫描单位400800线数每秒8001600线数每秒10002000线数每秒1212Speed扫描速度选择扫描速度选择功能：如果点击功能：如果点击SpeedSpeed按钮，会打开扫描速度调节对话框，选择不同按钮，会打开扫描速度调节对话框，选择不同 扫描速度扫描速度单向扫描单位400线数每秒（默认值 ） 800线数每秒1000线数每秒1313Zoom 电子放大电子放大 共聚焦
7、显微镜术中图像的放大倍数取决于物镜的放大倍数和电子共聚焦显微镜术中图像的放大倍数取决于物镜的放大倍数和电子 放大倍数。物镜的放大产生的原是图像本身就一个放大倍数，还放大倍数。物镜的放大产生的原是图像本身就一个放大倍数，还 可以通过电子放大进一步提高放大倍数。预电子放大倍数为可以通过电子放大进一步提高放大倍数。预电子放大倍数为2 2 的的 图像相比，电子放大倍数为图像相比，电子放大倍数为2 2时，扫描点数不变，边长减半，扫描时，扫描点数不变，边长减半，扫描 长的面积仅为原场的四分之一。这样提高了扫描的放大倍数和分长的面积仅为原场的四分之一。这样提高了扫描的放大倍数和分 辨率。辨率。 虽然放大倍数
8、能够提高很多，但也不是无限的放大的，其极限值虽然放大倍数能够提高很多，但也不是无限的放大的，其极限值 取决于物镜的分能力。取决于物镜的分能力。 对于易于漂白的样本、样本的荧光强度很低的样本、多光子扫描对于易于漂白的样本、样本的荧光强度很低的样本、多光子扫描 模式，建议少用电子放大。因为进行电子放大时，扫描频率增强模式，建议少用电子放大。因为进行电子放大时，扫描频率增强 ，扫描时间间隔减小，样本容易受到光损伤。，扫描时间间隔减小，样本容易受到光损伤。 默认值默认值 Zoom=1Zoom=11X2X4X8X16X32X64Xothers1414一一. .概述概述二二. .影响共聚焦检测质量的主要设
9、备参数影响共聚焦检测质量的主要设备参数三三. .因样本的处理不当影响共聚焦检测质量的因样本的处理不当影响共聚焦检测质量的因素因素四四. .样本制作过程需要注意的问题样本制作过程需要注意的问题1515荧光标记后样品荧光强度低的可能原因有：荧光标记后样品荧光强度低的可能原因有：1.1.所使用的荧光探针浓度过低。所使用的荧光探针浓度过低。2.2.标记条件不适当：孵育的时间、温度不当，大多数情况下标记条件不适当：孵育的时间、温度不当，大多数情况下 都是样品与探针孵育温度太低或时间太短造成。都是样品与探针孵育温度太低或时间太短造成。3.3.荧光探针失效。这是一种很常见的标记失败原因。荧光探荧光探针失效。
10、这是一种很常见的标记失败原因。荧光探 针一般要低温保存、不要反复冻溶、应用液现用现配制，针一般要低温保存、不要反复冻溶、应用液现用现配制， 另外其要在保质期内使用。另外其要在保质期内使用。1616荧光标记后样品荧光强度低的可能原因有：荧光标记后样品荧光强度低的可能原因有：4.4.所用介质、所用介质、pHpH值不适当。例如值不适当。例如FITCFITC：在：在pH6-8pH6-8时，很难跨过时，很难跨过 完整的活细胞膜使之染色，但在。完整的活细胞膜使之染色，但在。pHpH为为9 9时，可以跨膜进时，可以跨膜进 入细胞。入细胞。5.5.细胞状态不正常。例如，有一些探针只标记活细胞，如果细胞状态不正
11、常。例如，有一些探针只标记活细胞，如果 细胞活性不够则难以标记上荧光。细胞活性不够则难以标记上荧光。6.6.探针溶解不充分。虽然加入溶液的探针量足够，但探针没探针溶解不充分。虽然加入溶液的探针量足够，但探针没 有完全溶解，因此，实际接触细胞的探针浓度很低。有完全溶解，因此，实际接触细胞的探针浓度很低。1717荧光标记后样品荧光强度低的可能原因有：荧光标记后样品荧光强度低的可能原因有：7.7.探针泄漏。例如，用可透细胞膜的探针探针泄漏。例如，用可透细胞膜的探针FDAFDA标记细胞后，应在标记细胞后，应在 4040分钟内测定，否则其从进人开始，分钟内测定，否则其从进人开始，120120分钟后，其荧
12、光就只剩分钟后，其荧光就只剩 下约下约1010，细胞内的荧光探针会大部分泄漏到细胞外。，细胞内的荧光探针会大部分泄漏到细胞外。8.8.探针选择错误。探针的化学形式直接影响标记的结果。例如探针选择错误。探针的化学形式直接影响标记的结果。例如 标记活细胞标记活细胞CaCa2+2+，使用，使用nu0-3nu0-3荧光探针时，其有两种形式，荧光探针时，其有两种形式，Fluo-Fluo- 3 3 AMAM和和Fluo-3Fluo-3；直接与活细胞共孵育标记时，要用荧光探针的；直接与活细胞共孵育标记时，要用荧光探针的 跨膜形式跨膜形式Fluo-3AMFluo-3AM，而不能用，而不能用Fluo-3Fluo
13、-3，后者可用显微注射等方，后者可用显微注射等方 式导入细胞。而式导入细胞。而Fura-2Fura-2采用双波长检测（比率法），采用双波长检测（比率法），Fluo-3Fluo-3是是 单波长检测，单波长检测，Fura-2Fura-2的激发波长是的激发波长是340nm340nm和和380nm380nm，发射波长为，发射波长为 510nm510nm。Fluo-3Fluo-3的激发波长是的激发波长是506nm506nm，最大发射波长为，最大发射波长为526nm526nm。 Fura-2Fura-2可以采用流式细胞仪检测，可以采用流式细胞仪检测，Fluo-3Fluo-3一般采用激光管聚焦一般采用激光管
14、聚焦 或荧光显微镜检测。或荧光显微镜检测。1818荧光标记后样品荧光强度低的可能原因有：荧光标记后样品荧光强度低的可能原因有：9.9.荧光干扰。样品中的自发荧光光谱范围很宽，有时会干扰荧光干扰。样品中的自发荧光光谱范围很宽，有时会干扰 正常细胞染色，例如，叶绿素的自发荧光光谱范围很宽且正常细胞染色，例如，叶绿素的自发荧光光谱范围很宽且 强度高，会覆盖某些红、黄、绿色荧光。强度高，会覆盖某些红、黄、绿色荧光。10.10.荧光重合，例如。荧光重合，例如。FITCFITC的荧光光谱和的荧光光谱和GFPGFP的荧光光谱在有的荧光光谱在有 很大一部分是重合的，在荧光显微镜下很难分开。因此如很大一部分是重
15、合的，在荧光显微镜下很难分开。因此如 果不具备分开二者光谱的仪器设备，应尽量避免二者同时果不具备分开二者光谱的仪器设备，应尽量避免二者同时 出现在同一样品中。出现在同一样品中。1919荧光标记后样品荧光强度低的可能原因有：荧光标记后样品荧光强度低的可能原因有：11.11.观察样品荧光的条件不适宜。有时，虽然样品已经标记了观察样品荧光的条件不适宜。有时，虽然样品已经标记了 荧光，但是如果观察样品所使用的条件不适宜，也会观察荧光，但是如果观察样品所使用的条件不适宜，也会观察 不到荧光。例如不到荧光。例如APCAPC红标记的样品，其最大激发波长为红标记的样品，其最大激发波长为 650nm650nm，
16、用一般荧光显微镜很难看到；共聚焦显微镜激光，用一般荧光显微镜很难看到；共聚焦显微镜激光 谱线中用谱线中用633nm633nm的激光谱线才能采集到其图像。的激光谱线才能采集到其图像。12.12.有淬灭剂存在。如果介质中含有淬灭剂，也会使荧光下降有淬灭剂存在。如果介质中含有淬灭剂，也会使荧光下降 或完全淬灭。或完全淬灭。其他原因：例如，加入试剂种类、顺序错其他原因：例如，加入试剂种类、顺序错 误、漏加试剂及不当的操作均可导致荧光标记失败。误、漏加试剂及不当的操作均可导致荧光标记失败。2020一一. .概述概述二二. .影响共聚焦检测质量的主要设备参数影响共聚焦检测质量的主要设备参数三三. .因样本的处理不当影响而共聚焦检测质量因样本的处理不当影响而共聚焦检测质量 的因素的因素四四. .样本制作过程需要注意的问题样本制作过程需要注意的问题2121标本反复离心洗涤会造成细胞的粘附性降低，在免疫组标本反复离心洗涤会造成细胞的
