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1、12.1 12.1 分子发光分析概述分子发光分析概述12.2 12.2 荧光和磷光分析基本原理荧光和磷光分析基本原理12.3 12.3 荧光和磷光分析仪荧光和磷光分析仪 12.4 12.4 荧光和磷光分析法的特点与应用荧光和磷光分析法的特点与应用12.5 12.5 化学发光分析化学发光分析第12章 分子发光分析(Molecular Luminescence Analysis)n某些物质的分子吸收一定能量后，电子从基态跃 迁到激发态，在返回基态过程中，以光辐射的形 式释放能量，这种现象称为分子发光，在此基础 上建立起来的分析方法为分子发光分析法。较高激发态较高激发态基基 态态吸收能吸收能 量受激
2、量受激光辐射光辐射 退激退激分子在分子在退激退激过程中以光辐射形式释放能量过程中以光辐射形式释放能量12.1 12.1 分子发光分析概述分子发光分析概述n根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理 不同分为：光致发光：以光源来激发而发光化学发光：以化学反应能激发而发光化学发光分析 法本章对分子荧光分析、磷光分析和化学发光分析这三种分子发光分析法进行讨论。荧光荧光荧光分析法荧光分析法磷光磷光磷光分析法磷光分析法一、荧光和磷光的产生一、荧光和磷光的产生1. 1. 分子能级与电子激发态的多重度分子能级与电子激发态的多重度分子能级比原子能级复杂；每个电子能级中包含分子能级比原子能级复杂；每个电子能级中包含
3、 一系列的振动能级和转动能级。一系列的振动能级和转动能级。电子激发态的多重度：电子激发态的多重度：M = 2S + 1M = 2S + 1，S S为电子自旋量为电子自旋量 子数的代数和子数的代数和(0(0或或1)1)，因此，因此 M=1M=1（激发单重态激发单重态S S）或）或M=3M=3 （激发三重态激发三重态T T）。）。平行自旋比成对自旋平行自旋比成对自旋稳定稳定 ( (洪特规则洪特规则) )，三重态能级比相，三重态能级比相 应单重态应单重态能级低能级低；大多数有机分子的基态处于单重态。；大多数有机分子的基态处于单重态。12.2 12.2 荧光和磷光分析基本原理荧光和磷光分析基本原理S2
4、S1S0T1吸 收发 射 荧 光发 射 磷 光系间窜跃 内转换振动弛豫能 量 2 1 3外转换 2T2内转换振动弛豫因此，电子激发态有：因此，电子激发态有： 第一、第二、第一、第二、电子激发单重态电子激发单重态S S1 1 ，S S2 2 ， ; ;第一、第二、第一、第二、电子激发三重态电子激发三重态T T1 1 ， T T2 2 ， 。 激发过程：激发过程：基态基态(S(S0 0)激发态激发态( (S S1 1、S S2 2激发态振动能级激发态振动能级) ) ；去活化过程：去活化过程：激发态激发态基态：多种途径和方式基态：多种途径和方式( (见能见能级图级图) ) 。S2S1S0T1吸 收发
5、 射 荧 光发 射 磷 光系间窜跃 内转换振动弛豫能 量 2 1 3外转换 2T2内转换振动弛豫2.激发态基态的能量传递途径（荧光、磷光的产生 ）电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐 射跃迁射跃迁( (发光发光) )和无辐射跃迁等去活化过程失去能量。和无辐射跃迁等去活化过程失去能量。 传递途径辐射跃迁荧光磷光内转换系间窜跃振动弛豫无辐射跃迁以速率最快，速率最快，激发态寿命最短激发态寿命最短的途径占优。的途径占优。 荧光荧光：1010-7-710 10 -9-9 s,s,第一激发第一激发单重态单重态最低振动能级最低振动能级基态；基态；磷光磷
6、光：1010-4-410s10s；第一激发第一激发三重态三重态最低振动能级最低振动能级基态。基态。外转换非辐射能量传递过程：振动弛豫振动弛豫：同一电子能级内同一电子能级内以以热交换热交换形式由高振动能级形式由高振动能级 至低振动能级间的跃迁。这一失活过程极快（至低振动能级间的跃迁。这一失活过程极快（10 10 -12-12 s s）。）。内转换内转换：同一多重态同一多重态的两个电子能级间的非辐射跃迁过的两个电子能级间的非辐射跃迁过 程，如程，如S S2 2S S1 1 ， T T2 2 T T1 1等等系间窜跃系间窜跃：不同多重态不同多重态有重叠振动能级间非辐射跃迁。有重叠振动能级间非辐射跃迁
7、。 如如S S1 1 T T1 1等。改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋等。改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋轨道偶轨道偶 合进行。合进行。外转换：外转换：溶液中的激发态分子与溶剂或其他分子之间溶液中的激发态分子与溶剂或其他分子之间相相 互碰撞互碰撞而失去能量，并以热的形式释放。常发生在第一激发而失去能量，并以热的形式释放。常发生在第一激发 单重态（或三重态）的最低振动能级向基态转换的过程中。单重态（或三重态）的最低振动能级向基态转换的过程中。 外转换使荧光或磷光减弱或外转换使荧光或磷光减弱或“ “猝灭猝灭” ”。S2S1S0T1吸 收发 射 荧 光发 射 磷 光系间跨越内转换振动弛豫能 量 2
8、1 3外转换 2T2内转换振动弛豫辐射能量传递过程：荧光发射荧光发射：电子由第一激发电子由第一激发单重态单重态的最低振动能级的最低振动能级基基态态( (多为多为 S S1 1 S S0 0跃迁跃迁) )，1010-7-710 10 -9-9 s s内发射波长为内发射波长为 2 2的荧光的荧光。通常。通常发射荧光的能量比分子吸收的发射荧光的能量比分子吸收的能量能量小，波长长；小，波长长； 2 2 2 2 1 1 ；光照停止后，光线也随之很快地消失。光照停止后，光线也随之很快地消失。磷光发射磷光发射：电子由第一激发电子由第一激发三重态三重态的最低振动能级的最低振动能级基基态态( (T T1 1 S
9、 S0 0跃迁跃迁) )产生。先发生从激发单重态产生。先发生从激发单重态S S1 1振动弛豫振动弛豫内转移内转移系间跨越系间跨越振动弛豫振动弛豫 T T1 1的最低振动能级。的最低振动能级。发光速度很慢：发光速度很慢： 1010-4-4100 s 100 s ； 光照停止后，可持续一段光照停止后，可持续一段时间；磷光的波长更长：时间；磷光的波长更长： 磷磷 荧荧 激激 。 因此，荧光是单重因此，荧光是单重- -单重态的跃迁产生；磷光是三重单重态的跃迁产生；磷光是三重- -单重的跃迁产生。单重的跃迁产生。 发射光谱（荧光或磷光光谱）发射光谱（荧光或磷光光谱）固定激发光的强度和波长固定激发光的强度
10、和波长( (选最大激发波长选最大激发波长), ), 化合物化合物发射的荧光发射的荧光( (或磷光或磷光) )强度与发射光波长关系曲线强度与发射光波长关系曲线。二、激发光谱和发射光谱二、激发光谱和发射光谱激发光谱激发光谱固定测量波长固定测量波长( (选最大发射选最大发射波长波长) )，化合物发射的荧光，化合物发射的荧光( (磷磷光光) )强度与照射光波长的关系强度与照射光波长的关系曲线。曲线。两种光谱两种光谱可用于签别荧光（磷光）物质，亦可作为进行荧光可用于签别荧光（磷光）物质，亦可作为进行荧光（磷光）物质定量分析时选择合适激发波长和测定波长的依据。（磷光）物质定量分析时选择合适激发波长和测定波
11、长的依据。荧光光谱的基本特征a.Stokesa.Stokes位移位移在溶液的荧光光谱中，荧光波长总是大于激发光的波在溶液的荧光光谱中，荧光波长总是大于激发光的波 长的现象。振动弛豫等消耗了能量。长的现象。振动弛豫等消耗了能量。 b b. .发射光谱的形状与激发波长无关发射光谱的形状与激发波长无关电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量( ( 如能级图如能级图 2 2 , , 1 1) )，产生不同吸收带，但均回到，产生不同吸收带，但均回到第一激发第一激发 单重态的最低振动能级单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定再跃迁回到基态，产生波长
12、一定 的荧光的荧光( (如如2 2) )。 c c. . 镜像规则镜像规则通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形 状一样）成镜像对称关系。状一样）成镜像对称关系。S2S1S0T1吸 收发 射 荧 光发 射 磷 光系间窜跃 内转换振动弛豫能 量 2 1 3外转换 2T2内转换振动弛豫镜像规则的解释:基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似。振动能级分布类似。200250300350400450500荧光激发光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱三、荧光效率三、荧光效率分子能发射荧光取决于
13、两条件：分子能发射荧光取决于两条件：（1 1）具有合适的结构，能吸收激发光；）具有合适的结构，能吸收激发光；（2 2）具有一定的荧光效率（荧光量子产率）。）具有一定的荧光效率（荧光量子产率）。荧光量子产率（荧光量子产率（ ）：）： 通常小于通常小于1 1，在，在0.10.11 1时具有分析应用价值。荧光量子产时具有分析应用价值。荧光量子产 率低，是由于激发态分子释放激发能过程中除了荧光发射外，率低，是由于激发态分子释放激发能过程中除了荧光发射外， 还还存在多种非辐射跃迁与之竞争存在多种非辐射跃迁与之竞争，而这些非辐射过程不仅与分，而这些非辐射过程不仅与分 子结构有关，还与所处的环境密切相关子结
14、构有关，还与所处的环境密切相关。四、荧光与分子结构的关系荧光素和酚酞结构相似，荧荧光素和酚酞结构相似，荧 光素有很强的荧光，酚酞却没光素有很强的荧光，酚酞却没 有。为什么？有。为什么？ （1 1）具有共轭双键体系的分子具有共轭双键体系的分子： * 荧光效率高。共轭双键结构荧光效率高。共轭双键结构 有利于发荧光。共轭度高，荧光有利于发荧光。共轭度高，荧光 效率高并产生红移。因此，绝大效率高并产生红移。因此，绝大 多数能发荧光的物质为含有芳香多数能发荧光的物质为含有芳香 环或杂环的化合物。环或杂环的化合物。（2 2）刚性平面结构刚性平面结构：可降低分子振动，减少了系间窜跃至三：可降低分子振动，减少
15、了系间窜跃至三 重态及碰撞去活的可能性，有很强的荧光。重态及碰撞去活的可能性，有很强的荧光。 （3 3）取代基的影响取代基的影响：取代基的影响分成三类：n增强荧光的取代基 : -OH、-OR、-CN、-NR2等给电 子基团。由于基团的 n 电子云与苯环上的 轨道平 行，p-共轭作用，扩大了共轭体系，使荧光波长长 移，荧光强度增强。n减弱荧光的取代基：-COOH 、-NO2 、-COOR 、- NO、-SH 吸电子基团，使荧光强度减弱。 芳环上被F、Cl、Br、I 取代后，使系间窜跃加强， 磷光增强，荧光减弱。其荧光强度随卤素原子量增 加而减弱，磷光相应增强，这种效应为重原子效应 。n影响不明显的取代基 ：-NH3+、- SO3H等(1) 荧光定量关系式n用强度为I0的入射光，照射到液池内的荧光物质 时，透过光为It，并产生荧光If 。nIf = Ia= （I0- It ）I Ia a为为吸收的辐射强度吸收的辐射强度I I0 0为入射光强度为入射光强度荧光池I I0 0I It tI If f 荧 光强度检测器n n I If f= = （I I0 0- I- I0 01010-A-A ）= = I I0 0 （1 1-10-10-A-A ）I It t= = I
