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1、1,25(OH)1,25(OH)2 2D D3 3对脂多糖作用下大鼠腹膜间皮细胞维生素对脂多糖作用下大鼠腹膜间皮细胞维生素 D D 受受体及体及 TNFTNF、TGF-1TGF-1 表达的影响表达的影响杨丽娜，马健飞，陈硕，李丽燕，王力宁 摘要摘要 目的：目的： 研究脂多糖(LPS)对大鼠腹膜间皮细胞(RPMC)维生素 D 受体(VDR)及 TNF、TGF-1 表达的影响,从而为 1,25(OH)2D3在腹透相关腹膜炎中的应用提供理论基础 。方法：方法：胰蛋白酶消化法原代培养腹膜间皮细胞、传代、经鉴定后分组：(1)正常对照组； (2)脂多糖组：不同浓度的脂多糖(1，10，100g/ml)分别作
2、用 6h；10g/ml 脂多糖分别 作用 2，6，12h；(3) 1,25(OH)2D3作用组：10g/ml 脂多糖预孵育 2h 后，加 1,25(OH)2D3 (10-8mol/L,10-7mol/L,10-6mol/L)再作用 6h。RT-PCR 法检测 VDR mRNA 的表达；Western 印 迹法检测 VDR 蛋白表达；ELISA 法检测上清液 TNF、TGF-1 的表达。结果结果：与对照组相 比，LPS 组 RPMC VDR mRNA 和蛋白表达下降(P 0.05)。与 LPS 组相比，1,25(OH)2D3组 VDR mRNA 和蛋白表达显著增强(P 0.01)。LPS 组上清
3、液中 TNF、TGF-1 浓度显著高于对照 组 (P 0.01)；1,25(OH)2D3组上清液中 TNF、TGF-1 浓度显著低于 LPS 组 (P 0.01) 。结论：结论：LPS 能下调 RPMC VDR mRNA 和蛋白的表达，上调 TNF、TGF-1 表达；1,25(OH)2D3可逆转 LPS 所致的 RPMC VDR mRNA 和蛋白的表达上调，并下调 TNF、TGF-1 表达。V DR 与 TNF、TGF-1 表达负相关，VDR 对腹膜透析相关腹膜炎具有一定的保护作用，并具 有抑制腹膜纤维化的作用。 关键词关键词 脂多糖；1,25(OH)2D3；维生素 D 受体；TNF；TGF-
4、1；腹膜透析； EffectsEffects ofof 1,25(OH)1,25(OH)2 2D D3 3 onon ratrat peritonealperitoneal mesothelialmesothelial cellscells expressionexpression ofof vitaminvitamin D D receptor,receptor, TNFTNF andand TGF-1TGF-1 stimulatedstimulated byby lipopolysaccharidelipopolysaccharide. .YANG Li-na,MA Jian-fei,CH
5、EN Shuo,LI Li-yan,WANG Li-ning. Department of Nephrology,The First Affiliated Hospital,China Medical University,Shenyang 110001,China Corresponding author: MA Jian-fei,Email:AbstractAbstract ObjectiveObjective To observe the effect of 1,25(OH)2D3 on expression of vitamin D receptor(VDR),TNF-(tumor n
6、ecrosis factor-)and TGF-1 (transforming growth factor-1) in rat peritoneal mesothelial cell(RPMC) stimulated by lipopolysaccharide(LPS),so as to providesome theoretic basis for the clinical use of 1,25(OH)2D3 on peritoneal dialysis associated peritoneal inflammation . MethodsMethods RPMCs were isola
7、ted,cultured and passaged by enzymatic disaggregation,then identified by phase contrast inverted microscope,transmission electron microscope with immunocytochemistry method.RPMCs were incubated with LPS(1，10，100g/ml)and LPS(10g/ml)for 2,6,12 hours,or stimulated by 1,25(OH)2D3(10-8mol/L,10-7mol/L,10-
8、6mol/L)after incubated with LPS(10g/ml)for 2 hours.RPMCs in the control group were just incubated with medium.VDR mRNA was detected by RT-PCR, VDR protein was detected by Western Blot.In addition, Elisa analysis were performed to investigate the change of TNF-and TGF-1 in the culture medium. Results
9、Results Compared with the control group,the expression of VDR mRNA and protein were decreased in the group stimulated by high glucose(P 005),high glucose could significantly induce the expression of TNF-and TGF-1 in RPMC(P 001), which could be partially reversed by 1,25(OH)2D3 of 10-8-10-6mol/L(P 00
10、1). ConclusionConclusion 1,25(OH)2D3 could reverse the decrease of VDR mRNA and protein stimulated by LPS as well as induction of cytokines TNF-and TGF-1 up-regulated by LPS in RPMC in a dose and time dependent manner. VDR has a negative correlationship with TNF-and TGF-1.VDR could provide experimen
11、tal evidence of ameliorating peritoneal dialysis associated peritoneal inflammation and peritoneal fibrosis. KeywordsKeywords lipopolysaccharide；1,25(OH)2D3；vitamin D receptor；TNF-；TGF-1；peritoneal dialysis作者单位：110001，沈阳，中国医科大学附属第一医院肾内科。杨丽娜，E-mail:通讯作者：马健飞，E-mail:细菌性腹膜炎是腹膜透析的重要并发症，也是持续非卧床腹膜透析（CAPD）患
12、者透析 失败退出腹膜透析治疗的主要原因之一。脂多糖(LPS)是革兰阴性杆菌细胞壁的裂解成分， 是该类细菌的主要致病因素之一。LPS 通过与 TOLL 样受体 4(TLR4)结合，进而通过 MAP 激 酶和 NF-B 等途径调节基因的表达1。TNF- 是由单核巨噬细胞产生的具有多种活性的内 源性细胞因子，低浓度时主要调节炎症反应及促进组织修复，而在高浓度时，引起连锁和 放大反应即所谓的瀑布效应，致使脏器结构和功能受损。TGF-1 作为多功能的细胞因子， 具有促进炎症反应、调节炎症反应、致纤维化等多重生物学作用。维生素 D 受体(VDR)属于 类固醇激素/甲状腺受体超家族成员，主要介导其配体 1,
13、25(OH)2D3的生物学作用，如调节 钙磷代谢，调节免疫功能，调节细胞增殖和分化等。维生素 D 受体通过与其配体 1,25(OH)2D3结合后，转为活化形式，并与维甲酸核受体(RXR)形成异二聚体，后者与靶基因启动子 区域的维生素 D 反应成分(VDRE)结合，通过共激活或共抑制因子增强或抑制靶基因的转录， 影响 mRNA 的表达及蛋白质的合成。VDR 的抗炎抗纤维化作用已受到广泛重视，而对于腹膜 间皮细胞是否表达 VDR 以及 LPS 在维生素 D 系统中的作用还未知，为此，我们拟从大鼠腹 膜间皮细胞内研究进而探讨 LPS 对 VDR 的影响及可能机制。材料与方法材料与方法 一、材料 1.
14、实验动物：清洁级 SD 雄性大鼠，体重 120-160 克，由中国医科大学实验动物中心提 供。 2.主要试剂：DMEM/F12 干粉培养基和胎牛血清(美国 GIBCO),胰蛋白酶(美国 sigma) 1,25(OH)2D3和脂多糖粉剂(美国 Sigma),逆转录试剂盒(杭州博日)，兔抗大鼠 VDR 抗体 (Santa-Cruz),PCR 引物由上海生工公司合成。 二、方法 1.大鼠腹膜间皮细胞的原代培养，传代与鉴定：选择 120-160g 雄性 SD 大鼠,局麻后无 菌取大网膜,在 PBS 中洗去红细胞,然后用含 0.125 %胰蛋白酶、0.01 %EDTA 的 PBS 液消化 (37) 25
15、 min ,之后弃去消化液再加入胎牛血清(FBS)终止消化,吹打收集消化下来的单个 细胞, 4 下离心(800 r/min ,5 min),得到细胞团,用 DMEM/F12 培养液(含青、链霉素 100 U/ ml 及 20% FBS) 重悬细胞,接种于 25 cm2的培养瓶中,在 CO2 孵箱中培养 24 h 后 首次换液,以后每 23 d 换液 1 次。待细胞融合达 80 %时传代,用 PBS 洗 1 次后,加 0.125 %胰蛋白酶 2 ml 室温消化 3 min ,用 FBS 终止消化,4 离心,细胞团用 DMEM/F12 生长液重悬,以 2 106个细胞/ ml 的密度接种于 25
16、cm2的培养瓶中,在 CO2孵箱中培养 24 h 后首次换液,以后每 23 d 换液 1 次。第 2 代被培养的细胞汇合至 90%时经倒置相差显 微镜观察并用用细胞角蛋白抗体及波形蛋白抗体行免疫组化染色进行鉴定, 明确其为 PMC，纯度达到 99%以上。第 3 代细胞用于实验。参考文献22.实验分组：第 3 代腹膜间皮细胞达 90%融合时(细胞数约为 5106)进入实验，用 1% 胎牛血清培养基培养 24 h 同步化后，随机分为下列各组：(1)正常对照组：只加 1%胎牛血 清的 DMEM/F12 培养基；(2) 脂多糖组：不同浓度的脂多糖(1，10，100g/ml)分别作用 6 h；10g/ml
