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1、卵巢肿瘤组织中卵巢肿瘤组织中 nm23nm23 的表达和突变与其浸的表达和突变与其浸 润转移的关系润转移的关系肿瘤 1999 年第 4 期第 19 卷 医疗研究作者：李 力 张洁清 赵仁峰 姚德生 唐步坚 何靖育 陈心秋 古明华单位：李力 张洁清 姚德生 唐步坚 陈心秋 古明华 广西医科大学附属肿瘤医院妇科(南宁 530021)；赵仁峰 何靖育 广西自治区人民医院妇产科关键词：卵巢肿瘤；基因表达；肿瘤转移；聚合酶链反应；基因，nm23?卵巢癌极易在早期发生浸润和转移，是导致初诊时 70%已为晚期病人，60%的患者在首次手术时肿块直径超过 10 cm，并且有转移灶的重要原因1 。nm23 基因是
2、近年来分离鉴定的一种与抑制肿瘤转移相关的基因2 。为了探讨 nm23 基因的高表达与卵巢肿瘤浸润转移的关系，作者采用 RNA 聚合酶链反应(RT-PCR)以及多聚酶链反应-单链构象多态性分析技术(PCR-SSCP)对 41 例卵巢癌，20 例卵巢良性肿瘤和 21 例正常对照组织中的 nm23 基因高表达以及突变进行检测。现将结果报告如下。?材料与方法一、研究对象 全部标本均取自本科和广西自治区人民医院1996 年 3 月1997 年 5 月住院患者的手术切除标本，并经病理学检查确诊。分为(1)卵巢恶性肿瘤组，共 41 例其中上皮性肿瘤 33 例(粘液性癌 10 例，浆液性癌 11 例，内膜样癌
3、 2 例，低分化腺癌 10 例)，非上皮性肿瘤 8 例(内胚窦瘤 3 例，无性细胞瘤 2 例，颗粒细胞瘤，未成熟畸胎瘤，睾丸母细胞瘤各 1 例)。临床分期按 FIGO 标准(1988 年)，其中期 12 例，期 4 例，期 22 例，期 3 例。全部病例均接受手术加术后规则化疗，随访最短 6 个月，最长 20 个月，疗效评定按 WHO 四级评定标准3 。(2)卵巢良性肿瘤组，共 20 例，其中粘液性瘤 6 例，浆液性瘤 8 例，良性畸胎瘤 6 例。(3)正常卵巢组，共 21 例均来自子宫肌瘤手术同时行卵巢切除，病理学检查正常者。二、组织标本收集及处理 全部标本均在手术时收集，除一部分作常规组织
4、病理学检查外，其余立即放入液氮中保存待检。恶性肿瘤除在原发灶取材外，其中 23 例同时在癌旁和转移灶取材。三、nm23 表达的检测方法 1.组织总 RNA 的提取和 cDNA 的合成：组织中总 RNA 的提取采用酸性异硫氰酸胍一步法4 。提取的总 RNA 加适量经二乙基焦酸盐(DEPC)处理的去离子水溶解，取其中 10 l 经 1.0%琼脂糖电泳鉴定及紫外分光光度计定量，计算吸光度 A260/A280 比值，检测 RNA 纯度，比值均大于 1.80。取 1 g 总 RNA 合成 cDNA。逆转录 cDNA 试剂盒由Promega 公司提供，按说明书操作。2.PCR 扩增：(1)寡核苷酸引物制备
5、，引物的设计参考文献5 。由中科院上海生物工程研究中心合成，具体序列如下：nm23-H1：5-GCAGCCGCAGTTCAAACCTAA-33-GCTGGGAGGAAGCATTTTAATCA-5nm23-H2：5-CACCTTCATCGCCATCAAGCCG-33-CCACCTCTTATTCATAGACACC-5nm23-H1 及 H2 引物扩增 DNA 目的片段分别为 685 和475bp。(2)PCR 扩增反应：取 4 l(100 ng)反转录 cDNA 作PCR 扩增，总反应体积 20 l。含 25 mmol/L MgCl2；10 PCR Buffer；10 mmol/L dNTPs；2
6、u Taq DNA 聚合酶；nm23-H1引物 1.2 pmol，nm23-H2 引物 0.7 pmol。PCR 扩增反应采用三阶温控法，nm23-H1 为：94变性 60s、56 复性 60 s，72延伸 90 s，经 33 个循环后，72 延长 5 min。nm23-H2：94变性 60 s，55 复性 60 s，72 延伸 90 s，经 30 个循环后，72 延长 5 min。(3)PCR 产物电泳，采用非变性聚丙烯凝胶(PAG)电泳，方法参考文献6 。3. PCR 结果判断：PCR 扩增产物经电泳分离后，以 PCR-Marker 分子量参照物(华美和物工程公司提供)对比碱基对大小。以出
7、现明显的与目的基因碱基相同的区带(nm23-H1 为 685 bp，nm23-H2 为 475 bp)为阳性，见图1 和 2。图 1 nm23-H1 基因 RT-PCR 结果1：为 PCR-marker 分子量；2：阴性对照；3：正常组4，5：恶性肿瘤；6：良性肿瘤图 2 nm23-H2 基因 RT-PCR 结果1：为 PCR-marker 分子量；2：阴性对照；3，4：恶性肿瘤5：良性肿瘤；6：正常组织四、nm23 突变的检测方法 采用 PCR-SSCP 法，方法参考文献6，7 。用 0.1%硝酸银染胶，显带后立即拍照观察，见图3。图 3 nm23-H1 基因 PCR-SSCP 银染结果?1
8、：为 PCR-marker 分子量；2：正常对照；3：恶性肿瘤；4：良性肿瘤；五、统计学分析 采用 2 检验进行率的比较。结果一、各组中 nm23 mRNA 的表达情况卵巢恶性肿瘤组织中 nm23-H1 和 nm23-H2 表达率分别为73.2%(30/41 例)和 70.7%(29/41 例)，明显高于卵巢良性肿瘤(35.0%，7/20 例和 40.0%，8/20 例)和正常卵巢组织(28.6%，6/21 例和 33.3%，7/21 例)，相比较，差异有显著性(P0.010.05)。二、卵巢恶性肿瘤 nm23 表达与临床期别的关系期患者组织中 nm23-H1 和 H2 的表达率均为93.8%
9、(15/16 例)明显高于期患者的 60.0%(15/25 例)和56.0%(14/25 例)；相比较，差异有显著性(P0.05)。三、卵巢恶性肿瘤 nm23 表达与病理分类及分级的关系在 33 例上皮性癌中 nm23-H1 和 H2 表达率分别为72.7%(24/33 例)和 69.7%(23/33 例)；8 例非上皮性癌中 nm23-H1 和 H2 表达率分别为 6/8 和 5/8 例；两者相比较，差异无显著性(P0.05)；在病理分级中，高中分化者 nm23-H1 和 H2 表达率分别为 77.8%和 74.1%，而低分化者为 70.0%和 60.0%，相比较，差异也无显著性(P0.05
10、)。四、卵巢癌原发癌灶、癌旁及转移灶中的 nm23 表达情况原发癌灶中 nm23-H1 和 H2 表达率为 70.7%(29/41 例)，65.9%(27/41 例)；癌旁组织为 26.1%(6/23 例)和 30.4%(7/23例)；转移灶为 30.4%(7/23 例)和 26.1%(6/23 例)。相比较，原发灶的 nm23-H1 和 H2 表达率均明显高于癌旁与转移灶(P0.01)；但癌旁与转移灶相比较，其表达率差异无显著(P0.05)。五、卵巢恶性肿瘤 nm23 表达与近期疗效的关系对治疗有效(CR+PR)患者组织中 nm23-H1 和 H2 表达率为83.3%(25/30 例)和 8
11、0.0%(24/30 例)，而对治疗效果差者(NC+PD)的表达率为 45.5%(5/11 例)和 36.3%(4/11 例)；相比较，差异有显著性(P0.05)。六、各组中 nm23 突变情况21 例正常卵巢和 20 例卵巢良性肿瘤无 1 例发生突变。41例恶性肿瘤组织中，3 例 nm23-H1 突变，其中 2 例为低分化腺癌，1 例为浆液性癌；2 例为期患者，1 例为患者。3 例nm23-H2 突变，其中低分化腺癌，粘液性和浆液性癌各 1 例；3例均为期患者。讨论本研究结果显示，卵巢癌组织中 nm23-H1 和 H2 的表达率高于良性及正常对照，同时显示不同病理类型及分级的 nm23 表达
12、率无显著性差别，这与 Srivatsa 等8研究报道一致。这表明 nm23 与多数其它癌基因表达的特征相似，它的过度表达仅与组织细胞的恶性变有关。本组资料观察的结果显示：(1)期患者组织中 nm23-H1 和 H2 表达率明显高于期。(2)原发癌灶组织中 nm23-H1 及 H2 表达率也明显高于转移灶，这些结果提示，卵巢恶性肿瘤组织中的 nm23 表达与其转移浸润有关。已有研究表明，nm23 在恶性肿瘤组织中起着抑制转移的作用，它的编码产物在癌细胞中起初增高，当肿瘤出现转移时降低2 。本研究也发现，癌旁组织中 nm23-H1 及 H2 的表达率明显低于原发灶，这可能与(1)活检标本含有较多的
13、正常细胞；(2)癌旁组织发生浸润的癌细胞本身的 nm23 表达水平降低有关。nm23-H1 和 H2 两个亚型，究竟谁起主要作用，目前尚不清楚，但有报道 H1 及 H2 可能有两个独立的调节系统9 。也有研究结果表明 H2 与肿瘤的转移浸润更密切8 。但本组资料结果尚未发现两者在卵巢癌浸润转移中的差异，因此，对于两者之间的作用机理还有待进一步研究。本研究发现，卵巢恶性肿瘤组织中 nm23-H1 和 H2 的突变率仅为 7.3%。而全部出现在期患者。这与 Mandai10等的研究结果大致相同。有学者认为 nm23 突变导致其编码蛋白的亚单位比例失衡，使编码蛋白的结构和功能发生改变，一方面影响微管
14、聚合，导致染色体畸形和非整倍体形成，从而驱动肿瘤转移；另一方面可通过细胞骨架和微管聚合或 G 蛋白介导的对细胞粘合素信号反应的变化，引起细胞运动的改变，促进浸润过程5 。也有学者认为 nm23 突变是导致其表达量减少的原因10 。但本研究并未发现所有有转移浸润的癌组织中的nm23 发生突变，其原因尚待研究探讨。已有研究结果提示 nm23 表达阴性的患者生存期短，预后差。因此提示 nm23 表达的减少预示着不良的预后5 。本研究也发现，nm23-H1 及 H2 表达阳性的患者近期疗效好于表达阴性者，但作者尚未对患者进行远期的随访分析。因此，nm23 的表达与卵巢癌患者预后的关系有待进一步的远期随
15、访资料给予证实。第一作者简介 李 力，硕士，副教授。*项目受自然科学基金(39560081)资助参考文献1 Omurn GA,Brady MF,Homesley HD, et al. Long term follow-up and prognostic factor analysis on advanced ovarian carcinoma:the gyneologic oncology group experience.J Clin Oncol,1991,9:1138?2 Steeg PS,Bevilacqua G,Kopper L, et al. Evidence of a novel
16、gene associated with low tumor metastatic potential.J Natl Cancer Inst,1988,80:200?3 Miller AB,Hoogestrten B,Stacuet M, et al. Reporting results of cancer treatment.Cancer,1981,47:207?4 Chomczynski P,Sacchif N,Single-step mothod of RNA isolation by acidguanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.Ann Biochemi,1987,162:159?5 Iizuka N,Oka M,Noma T, et al. Nm23-H1 and nm23-H2 messenger RNA abundance in human
