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1、单精子卵胞浆内穿刺单精子卵胞浆内穿刺 术治疗男性不育症的术治疗男性不育症的 探讨探讨( (附附 2323 例报告例报告) )临床泌尿外科杂志 2000 年第 4 期第 15 卷 临床研究作者：黄学锋 郑菊芬 周颖 林金菊 赵军招 叶碧绿 李澄棣单位：温州医学院附属第一医院生殖医学中心，浙江温州，325000关键词：单精子卵胞浆内穿刺术；男性不育症；妊娠摘要 目的：探讨单精子卵胞浆内穿刺术（ICSI）治疗严重精液异常和梗阻性无精子症所致不育的疗效。方法：对 23 例严重精液异常和梗阻性无精子症患者施行 ICSI，女方行常规超促排卵以获取卵子并选择成熟的卵母细胞，同时采用手淫法、经皮附睾穿刺术（P
2、ESA）和睾丸精子获取术（TESE）以获得精液、附睾及睾丸精子行 ICSI。结果：23 例 23 个治疗周期共获卵 332 个，其中 300 个成熟卵母细胞进行了ICSI，193（64.3%）个卵子正常受精，形成 180 个胚胎，每个治疗周期移植胚胎 24 个（平均 3.07 个） ，8 例获得临床妊娠，2 例系双胞胎，总周期临床妊娠率为 34.8%。其中 11 例 11 个治疗周期采用精液精子行 ICSI，4 例妊娠；12 例 12 个治疗周期采用附睾精子或睾丸精子，4 例妊娠。结论：ICSI 可以有效地治疗严重的精液异常和梗阻性无精子症所致的不育症。Intracytoplasmic spe
3、rm injection for treatment of severe male infertility (Report of 23 cases)HUANG Xue-feng ZHENG Ju-fen ZHOU Ying LIN Jin-juZHAO Jun-zhao YE Bi-lu LI Cheng-di(Reproduction Medicine Unit, Wenzhou Medical College 1st Affiliated Hospital, Wenzhou, Zhejiang，325000)Abstract Purpose:To investigate the effic
4、acy of ICSI treatment for severe male factor infertility.Methods: The female partners were routinely superovulated and had oocyte retrieval under transvaginal ultrasound. MII oocyte was selected to be microinjected with a single spermatozoon, which was prepared from semen, PESA and TESE samples resp
5、ectively .Results: Among 332 oocytes retrieved, 300 MII oocytes were microinjected, 193 (64.3%) oocytes were normally fertilized, 180 fertilized oocytes cleaved to embryos. 24 (mean 3.07) embryos were replaced into uterus for each transfer. 8 clinical pregnancies (2 twin) were achieved, with a pregn
6、ant rate per cycle of 34.8%. 4 pregnancies resulted from 11 ICSI cycles with semen spermatozoa and 4 from 12 cycles with epididymal or testicular spermatozoa. Conclusions: ICSI is an effective method to treat severe male infertility.Key words Intracytoplasmic sperm injection Male infertility Pregnan
7、cy自 1992 年 Palermo 等1采用单精子卵胞浆内穿刺术（ICSI）治疗严重精液异常的男性不育症获得成功以来，ICSI已被广泛用于治疗男性严重不育症。我们于 1999 年 28 月采用 ICSI 技术治疗严重精液异常和梗阻性无精子症 23 例(23 对夫妇，每例为 1 个治疗周期)，其中 8 例获得临床妊娠，现报告如下。1 资料与方法1.1 临床资料本组不育夫妇 23 对，女方年龄 2139 岁，平均 30.1 岁；男方年龄 2543 岁，平均 32.5 岁。不育年限 212 年。4 例为继发性不育，19 例为原发性不育。3 例在外院行常规 IVF 或ICSI 治疗失败，其余 20
8、例均系首次治疗。11 例系严重精液异常；12 例系梗阻性无精子症，其中 2 例为先天性双侧输精管缺如，10 例为炎症性附睾梗阻。2 例先天性双侧输精管缺如和 8例精子密度少于 5109/L 的患者行染色体核型检查，均为46，XY。1.2 治疗方法1.2.1 女方超促排卵及处理：治疗前，女方使用促性腺激素释放激素激动剂（GnRH） 、卵泡刺激素（FSH）和人绒毛膜促性腺激素（HCG）行常规超促排卵2 ，经阴道 B 超行卵泡抽吸术获得卵子。在 ICSI 操作之前，将卵丘复合物置于含透明质酸酶 16104 IU/L 及含 10%母体灭活血清的 HTF-Hepes 中剥离颗粒细胞。1.2.2 精子获取
9、及处理：精液异常者在禁欲 3 d 后(取卵当天)手淫获得精液，采用 Percoll 或微量 Percoll 的方法收集活动精子。无精子症者首先行经皮附睾精子抽吸术（PESA） ，如附睾液中未发现精子，则立即行睾丸精子获取术（TESE） 。经开放性睾丸活检术获得米粒大小睾丸组织，放入 HTF-Hepes(Irvine scientific,9529)中，将睾丸组织在培养皿底部的井字划痕上来回搓动，将睾丸精曲小管磨碎，在含精曲小管组织碎片的培养液中可找到睾丸精子。为改善精子活动力，附睾和睾丸精子可行短期培养。在作 ICSI 前，精子需用含 10%母体灭活血清的 HTF-Hepes 洗涤 3 次。1
10、.2.3 ICSI 操作：ICSI 操作参照 Payne3介绍的方法进行。采用商品化的 ICSI 注射针，内外径为 5 和 7 m。自制ICSI 持针，尖端内外径为 20 和 100120 m。ICSI 操作在配有微分干涉光学系统（DIC）的 Zeiss 倒置显微镜的温台(37)上进行。采用两个粗调操作器和两个液压细调操作器(MN-188和 MO-188，Narishige)控制显微持针和注射针的移动。一个显微注射器控制显微持针内的压力吸引固定卵子，而精子的吸取和注射及卵胞浆的抽吸由内充硅油的 1 ml 一次性注射器控制。按下法制作 ICSI 操作皿：将 5 l 的 10% PVP(Irvin
11、e scientific,99219)置于 Petri 皿(Falcon 1006，Beckon dickison)中央，在 PVP 微滴周围放置 8 个 5 l 的含 10%母体灭活血清的 HTF-Hepes 微滴，尽快用石蜡油(M8410，Sigma)遮盖微滴，以免渗透压改变。在 ICSI 操作前，将处理后的精子放入 12 个 HTF-Hepes微滴，而将卵子放入其他的 HTF-Hepes 微滴，每次卵子总数少于 5 个。在精子微滴中选择形态正常的活动精子转移到 PVP 微滴中，用 ICSI 注射针在培养皿底部猛烈划破精子的尾部，将制动的精子吸入注射针，尾部先吸入，使精子置于注射针尖端。将
12、含精子的显微注射针和持针放入含卵子的微滴中，MII 期的卵子由持针吸引固定，使第一极体位于 12 或 6 点的位置。将ICSI 注射针穿过透明带刺入卵子胞浆内，回抽部分胞浆后将回抽的胞浆和精子注入卵子，缓慢退出注射针。重复以上过程，对每个 MII 期卵子行 ICSI。1.2.4 穿刺卵培养：将穿刺后的卵子置于含 10%母体灭活血清的 Earles（Sigma，E2888）或 HTF 培养液（Irvine scientific, 9528）中，在 37含 5%CO2 的湿化空气中培养。1618 h 后观察注射卵子是否正常受精，即是否有 2 个原核和2 个极体。穿刺后 4048 h 观察有否卵裂。
13、1.2.5 胚胎转移和妊娠观察：受精后 2432 h,将不超过4 个形态学评分的最佳胚胎经阴道植入子宫。2 周后检测尿和血HCG，确定是否妊娠，5 周后 B 超观察妊娠囊和搏动胎心数目，以确定是否临床妊娠和多胎妊娠。2 结果在 23 例 23 个治疗周期中共获卵 332 个，其中 MII 期卵子308 个。300 个 MII 期卵子进行了显微注射，27 个 MII 期卵子注射后坏死，卵子损伤率为 9.0%；193 个卵子正常受精，总受精率为 64.3%，形成 180 个胚胎，卵裂率为 93.3%。所有治疗周期均有胚胎移植，移植数 24 个（平均 3.07 个） ，其中 8 例获得临床妊娠，2
14、例系双胞胎，均在继续妊娠中。总周期临床妊娠率为 34.8%，胚胎种植率为 14.1%。在 23 例 23 个治疗周期中，11 例 11 个治疗周期采用精液精子行 ICSI，4 例妊娠，其精液指标和治疗结果见表 1。对 12例梗阻性无精子症患者，5 例 5 个治疗周期采用经 PESA 获得的附睾精子，7 例 7 个治疗周期采用经 TESE 获得的睾丸精子，共获得 4 例妊娠。采用精液、附睾和睾丸精子的受精率分别为60.8%、63.2%和 69.9%，临床妊娠率分别为 36.4%（4/11） 、60.0%（3/5）和 14.3%（1/7） 。表 1 异常精液指标和治疗结果例序精子密度/(109.L
15、-1)活动率/%畸形率/%治疗结果 10.11)-20.2590 妊娠 365.01568 43.6168053.0158769.0370 妊娠 2)74.02274811.01873妊娠 2)90.11)-妊娠 102.02562112.41280 1) 在低倍视野下偶见活动精子，未评价活动率和畸形率2) 双胎妊娠3 讨论严重的精液异常和无精子症患者缺乏有效的男性学治疗方法。体外受精-胚胎转移结合透明带穿孔（PZD）和透明带下精子注射（SUZI）曾被用来治疗严重的精液异常和无精子症，但受精率和妊娠率较低。ICSI 的出现给这些难治的不育症患者提供了目前最有效的治疗方法，每周期临床妊娠率达25
16、%52%4 。ICSI 治疗成功的关键之一是获得较高的卵子受精率，而有经验的操作者往往可获得 50%80%的受精率4 。正常受精失败主要是由于卵子机械损伤、精子未注入卵子、卵子不能被激活、激活后原核不能形成和不能形成第二极体所致5 。获得高质量的卵子和熟练的 ICSI 操作是减少卵子损伤的关键。文献报道卵子损伤率一般为 7%14%4 ，本组卵子损伤率为 9%，与之相符。精卵融合后的卵子激活是自然受精过程的关键，将促使卵子完成核的成熟、合成蛋白质和 DNA。由于缺乏自然的精卵融合而直接将精子注入卵子胞浆内，一些促使卵子激活的 ICSI 操作技术成了获得较高的卵子受精率的关键。研究表明，将精子尾部猛烈划破制动精子，有助于精子注入卵子后释放卵子激活因子，激活卵子和促进原核形成6 。卵子胞浆的钙内流和波动在卵子激活中起着重要作用，而在注入精子前回抽卵胞浆可以获得更高幅度的钙波动而激活卵子，并可确定精子已注入卵胞浆，将受精率从 38%提高到 80%7 。我们采用了这些关键操作技术，在 2
