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1、丁酸钠诱导卵巢癌丁酸钠诱导卵巢癌 3AO3AO 细胞凋亡的研究细胞凋亡的研究【摘要】目的探讨丁酸钠（NaB）诱导卵巢癌细胞株 3AO 凋亡的机制。方法以不同浓度的 NaB 对体外培养的 3AO 细胞进行作用，通过光镜和 DNA 琼脂糖凝胶电泳观察凋亡发生与药物剂量和作用时间的关系，进而选取 4mmol/LNaB 作用 72h 的 3AO 细胞为实验组，应用流式细胞技术分析 Fas/FasL、bcl2/Bax 表达和线粒体跨膜电位的变化，透射电镜观察内质网形态的变化。结果4mmol/LNaB 作用 72h，光镜下可见 3AO 细胞出现凋亡改变，DNA琼脂糖凝胶电泳中出现典型的 DNA ladde
2、r, 线粒体跨膜电位降低，内质网肿胀，bcl2 表达降低，Bax 表达升高，而Fas/FasL 无明显改变。结论 NaB 可能通过线粒体通路和内质网通路诱导 3AO 细胞凋亡，bcl2/Bax 起着重要的调控作用。 【关键词】 丁酸钠 卵巢肿瘤 细胞凋亡 丁酸是食物纤维成分在大肠正常菌群作用下产生的一种四碳脂肪酸，体外实验证实其钠盐可诱导多种细胞凋亡，其机制不明。目前认为细胞凋亡径路大致有三条： 死亡受体通路；线粒体通路；内质网通路1 。本研究，以实体瘤细胞株人卵巢上皮癌 3AO细胞为肿瘤模型，从形态学、生物化学、流式细胞学等角度，观察分析各凋亡通路相关指标，探讨 NaB 诱导卵巢癌细胞凋亡的
3、机制，为 NaB 的开发和临床卵巢癌化疗提供新思路。1 材料与方法1.1 细胞系与主要试剂人卵巢上皮癌细胞株 3AO，由中国医学科学院山东分院免疫室提供。丁酸钠纯品 （Sodium butyrate,NaB）为日本和光纯药工业株式会社产品。Rho123,sigma 公司产品。小鼠抗人单克隆抗体 Fas（C20） FasL(Nok1) bcl2(C2) Bax(N20), 异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate,FITC）标记羊抗鼠 IgG 抗体，为美国 Pharmingen 产品,购自北京岳泰生物公司。1.2 细胞形态学观察浓度为 5104/ml 的 3AO 细胞悬
4、液接种于预置盖玻片的24 孔培养板中，每孔 1ml,过夜贴壁，第 2 天更换 NaB 浓度为0mmol/L、2mmol/L、4mmol/L、8mmol/L、12mmol/L 的培养液，培养 72h,常规制备细胞爬片，HE 染色，光学显微镜下观察。1.3 DNA 降解分析细胞在含不同浓度 NaB 的培养液中培养 72h,收集细胞，清洗，离心，采用常规的蛋白酶 K 消化、酚/氯仿抽提和乙醇沉淀法提取 DNA, 2%的低熔点琼脂糖凝胶点样电泳，紫外灯下观察并摄影。1.4 Fas/FasL 的检测取空白培养液和含 4mmol/LNaB 的培养液作用 72h 的细胞，胰酶消化细胞并漂洗，加小鼠抗人 Fa
5、s(C20)和 FasL(NOK1)单克隆抗体，于 37孵育 1h。漂洗后离心，用羊抗鼠 IgGFITC标记，4,45min,用 FAScan 分析 Fas 和 FasL 荧光强度。1.5 线粒体跨膜电位检测取空白培养液和含 4mmol/LNaB 的培养液作用 72h 的细胞，经PBS 清洗两次后，与 10g/ml 的 Rhodamine(Rh)123 37孵育 30min。PBS 清洗两次，加碘化丙啶（PI,5g/ml）染色5min 后在流式细胞仪上检测 Rh123 和 PI 的荧光强度。1.6 内质网观察收集 NaB 浓度为 0mmol/L 和 4mmol/L 培养液培养的细胞，离心成团，
6、2.5%戊二醛固定，常规电镜制样，日立 H-800 电镜观察。1.7 bcl2/Bax 测定取空白培养液和含 4mmol/LNaB 的培养液作用 72h 的细胞，胰酶消化并漂洗，加小鼠抗人 bcl2(C2)和 Bax(N20)单克隆抗体，于 37孵育 1h。漂洗后离心，用羊抗鼠 IgGFITC 标记，4,45min,用 FAScan 分析 bcl-2 和 Bax 荧光强度。1.8 统计学处理采用 sas 6.12 统计软件，做 t 检验。2 结果2.1 光镜下细胞组织形态学改变对照组：见图 1。实验组：当用药浓度为2mmol/L 时，细胞生长未见明显抑制，4mmol/L 以上，随药物浓度增加，
7、贴壁的正常细胞数逐渐减少，并可见较多的凋亡细胞，见图 2。2.2 琼脂糖凝胶电泳图像 用药浓度2mmol/L 没有 DNA ladder 出现，4mmol/L 处理细胞后可见典型的 DNA ladder, 12mmol/L 处理细胞后仅见模糊的膜状条带而无 DNA ladder 形成，为细胞坏死的凝胶电泳图像，见图 3。2.3 Fas/FasL 的表达 4mmol/LNaB 作用 72h,Fas 蛋白的表达为（2.380.19）%，与对照组（2.080.04）%比较，差异无显著性（P0.05）; 4mmol/LNaB 作用 72h,FasL 蛋白的表达为（4.01图 3 不同浓度丁酸钠作用 7
8、2h,DNA 降解分析0.24）%，对照组 FasL 蛋白的表达为（3.630.05）%，两者比较亦无显著性差异（P0.05） 。2.4 线粒体跨膜电位(m)的变化 PI 为膜非通透性 DNA 结合荧光染料，Rh123 是由线粒体吸收的亲脂染料。细胞经 PI 和 Rh123 双重染色。经流式细胞仪分析，分别以 Rh123和 PI 的荧光强度为横坐标和纵坐标，这些细胞分成 3 个亚群，即完整的细胞膜和稳态m 的活细胞（右下向限） ，细胞膜完整但m 下降的凋亡细胞（左上向限） ，和细胞膜及m 均遭破坏的死细胞（左下向限） 。我们发现对照组细胞多分布在右下向限，4mmol/LNaB 作用 72h,
9、左上向限和左下向限的细胞增多，m 下降。2.5 内质网的变化 4mmol/LNaB 作用 72h 可见内质网数量减少，囊泡状扩张，且向核周聚集，见图 4。图 4 丁酸钠作用后内质网扩张2.6 bcl2/Bax 的表达 4mmol/LNaB 作用 72h,bcl2 蛋白的表达为(1.810.26)%，与对照组(5.540.34)%比较，差异有显著性（P0.05） ；4mmol/LNaB 作用 72h,Bax 蛋白的表达为(25.352.4)%，与对照组(5.230.2)%比较，升高且有显著性差异（P0.05） 。3 讨论NaB 作为一种分化诱导剂，早在 70 年代中期就应用于白血病的治疗研究中，
10、近来发现它可诱导体外培养的多种肿瘤细胞凋亡。本研究发现一定浓度的 NaB 作用一定时间，可以诱导 3AO细胞凋亡，光镜下可见核浓缩等形态学改变，琼脂糖凝胶电泳中可见典型的 DNA 梯形条带，这些均是细胞凋亡的特异性指标。NaB 通过何种通路诱导凋亡尚未阐明，故我们对三条通路的相关指标进行了检测。首先，针对死亡受体通路，检测了Fas/FasL 蛋白的表达。我们发现 3AO 细胞 Fas/FasL 的表达水平较低。与文献报道一致2 。相当多的人类恶性肿瘤细胞存在着 Fas 分子的低表达或缺失3 ，这可能是不能触发 T 细胞诱导肿瘤细胞凋亡使肿瘤细胞逃避免疫监视、肿瘤形成及进展的原因之一。3AO 细
11、胞 Fas/FasL 表达量偏低，可能是其增殖迅速的原因之一；4mmol/LNaB 作用 72h, Fas/FasL 表达无明显改变，即未出现 Fas/FasL 的上调，提示 NaB 可能不通过死亡受体通路介导凋亡。线粒体跨膜电位（m）是三羧酸循环产生的能量传递给电子，电子传递过程中释放能量，将质子从基质泵入膜间腔而形成，m 是衡量线粒体功能是否正常的一个重要指标，m 的下降是凋亡的一个早期特征。在 NaB 诱导 3AO 细胞凋亡的过程中，m 下降，我们推测，NaB 作用使线粒体膜通透性增加，从而导致线粒体跨膜电位降低，促凋亡物质释放，当作用达一定时间，m 崩解，活化链反应，细胞便进入不可逆的
12、凋亡过程，出现核染色质浓集、DNA ladder 形成等典型的凋亡表现4 。内质网（endoplasmic reticulum, ER）是由膜性小管、小泡及扁平囊连接而成的连续性网状结构，遍布于细胞质中，在蛋白质脂类合成、物质运输以及细胞其他膜性细胞器的形成等方面均起着重要的作用5 。研究发现，Caspase12 存在于内质网，促凋亡物质可引起内质网功能失调，激活caspase12,进而剪切 Caspase3,引发细胞凋亡6 。NaB 作用后，内质网减少，呈囊泡状扩张，向核周聚集，这些变化可能与合成凋亡过程所需蛋白质有关。死亡受体通路、线粒体通路、内质网通路各自独立，又相互联系，bcl2 家族
13、在各通路的调控中发挥重要作用，其中bcl2/Bax 是 bcl2 家族两个具有代表性的重要成员，分布于线粒体和内质网膜上，研究表明，bcl2 过表达可使三条通路诱导的凋亡均受到抑制7,8 ；而 Bax 过表达则可导致线粒体跨膜电位丢失及细胞色素 C 释放，从而促进线粒体通路诱导的凋亡。本研究显示，NaB 作用后，bcl2 表达降低，Bax 表达升高，提示，它们参与了 3AO 细胞凋亡的调节。通过上述分析我们认为 NaB 可能通过线粒体通路和内质网通路诱导 3AO 细胞凋亡，bcl2/Bax 起着重要的调控作用，死亡受体通路是否参与此过程有待进一步研究。(本文图 1、2 见封 2)【参考文献】1
14、朱晓东，林庚金，钱立平，等. 凋亡通路及其调控研究进展J.国外医学生理、病理科学与临床分册,2002，22（3）:248.2Strand S, Hofmann WJ, Hug H, et al. Lymphocyte apoptosis induced by CD95 (Apo1/Fas) ligandexpressing tumor cells: a mechanism of immune evasion J. Nat Med, 1996,2(12):13611366.3Hug H. Fasmediated apoptosis in tumor formation and defense J
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