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1、固定化酶载体-壳聚糖学 号 : 81050636报 告 人 : 胡 探 宇研究背景 1.酶是一种蛋白质，对环境变化的耐受力极 低,稳定性差，大大限制了它的大规模应用.2.在催化结束后难以回收。3.通过固定化技术对酶加以改造固定。但至 今，还没有一种固定化方法可以普遍地适用 于每一种酶，特定的酶要根据具体的应用目 的选择特定的固定化方法。研究目的o固定化酶具有游离酶无法比拟的优势,它 对温度、pH值、溶剂极性等具有极高的 耐受性,并能反复回收使用。适应工业化 生产.o壳聚糖作为酶固定化载体时能针对不同酶 制成不同形态,酶固定化后耐酸碱性强,耐 热性好, 活性不受金属离子干扰;加上它们 的环保性,
2、还可减轻环境污染.回顾历史 1953年,首次提出酶固定化方法. 20世纪60年代,酶的固定化技术兴起. 1969年,日本首先研制成功固定化酶技术 。固定化酶的概念与性质酶固定化(Immobilization of enzymes)是指用固体材料将 酶束缚或限制于一定区域内,使其仍能进行本身所特有的 催化反应、并可回收及重复使用的一类技术。固定化酶一般是呈膜状、颗粒状或粉状的酶制剂，它在一 定的空间范围内使用，产品的纯度高，可反复使用.固定化酶同自由酶相比，具有以下优点：其一是稳定性高 ,对环境的变化抵抗力强；其二是酶的回收简单,可反复使 用；其三是产物纯度高；其四是生产可连续化和自动化； 其五
3、是设备小型化以及可节约能源等。使酶的综合利用, 酶反应的快速终结,酶生产线的连续运转,以及多种生物反 应器的设计等成为现实。固定化的主要形式酶能以多种方法固定 于载体上,大致可分为 :(1)共价结合法;(2) 吸附法;(3)交联法;(4)包埋法。壳 聚 糖壳聚糖(chitosan)又名氨基葡萄 糖,是由2-氨基-2-脱氧-D-葡萄 糖以(14)糖苷键连接而成的 直链多糖,它是目前发现的唯一 的一种天然的碱性多糖。用碱 脱去甲壳素2位碳上的乙酰基可 得到壳聚糖。 壳聚糖分子链上的游离氨基能 从酸性溶液中结合氢离子,成为 带正电荷的聚电解质,破坏了分 子间和分子内的氢键,从而可溶 于一些低浓度无机
4、酸和有机酸 。另外壳聚糖分子结构中含羟 基和氨基,使其易于进行酰化、 酯化、醚化、烷基化、氧化、 螯合等化学修饰和改性。 壳聚糖及其衍生物对人体无毒, 具有良好的生物相容性和生物 可降解性.壳聚糖作为酶固定化载体优良性能甲壳素/壳聚糖,能以低廉的成本从甲壳类动物的硬壳中获 得,也可从海产品加工业的废物中获得。 壳聚糖分子中含丰富羟基和氨基使其易于进行化学反应而 赋与其许多独特的性能,特别是其丰富的氨基与各种蛋白 质的亲和力非常高;大多聚合物载体中含残存单体易使酶 失活,而壳聚糖没有残存的单体。 酶固定化的成功决定于酶与固定化载体的良好结合而不破 坏酶的生物催化特性。固定化载体一般应具有良好的化
5、学 稳定性和机械刚性、容易再生等基本性质,而且必须能吸 附蛋白质,有能与酶表面基团相作用的功能团,具亲水性和 良好的生物相容性,且可根据酶的特性做定向化学修饰。 壳聚糖具备上述全部性质.壳聚糖与其它载体的酶和细胞固定化性能比较多孔壳聚糖微球制备及形态观察1 试验方法1) 壳聚糖基本性质测定2) 壳聚糖微球的制备3) 壳聚糖微球形态及结构观察 2 结果与讨论1) 壳聚糖基本性质测定结果2) 壳聚糖分子量对壳聚糖成球的影响3) 成球条件对壳聚糖成球的影响1 NaOH浓度对壳聚糖成球的影响2 壳聚糖浓度对壳聚糖成球的影响3 凝结液中处理时间对壳聚糖成球的影响4 壳聚糖微球内部结构 3 结 论前 言
6、甲壳素和壳聚糖是天然的聚氨基葡萄糖,呈现出疏松的 网状结构,在大多数溶剂中是不能溶解的.壳聚糖凝胶形 成的微球具网状结构,机械性能良好,化学性质稳定,耐 热性好,特别是其分子中存在的大量氨基使它能在pH6. 5以下的酸性溶液中溶解,既易与酶共价结合,又可络合 金属离子,使酶少受金属离子的抑制,同时它又易于通过 接枝而改性。制备表面疏松多孔的壳聚糖微球探讨影响壳聚糖成球的因素探讨影响壳聚糖成球的因素, ,制备多孔的壳聚糖微球以制备多孔的壳聚糖微球以 增加微球的表面积增加微球的表面积, ,增加酶分子与壳聚糖分子的接触机增加酶分子与壳聚糖分子的接触机 会会, ,有利于壳聚糖吸附酶分子及与酶分子交联。
7、有利于壳聚糖吸附酶分子及与酶分子交联。1 壳聚糖基本性质测定2 壳聚糖微球的制备1)不同分子量壳聚糖微球的制备2)不同NaOH浓度下壳聚糖微球的制备3)不同壳聚糖浓度的微球的制备4)不同凝结时间的壳聚糖微球的制备3 壳聚糖微球形态及结构观察壳聚糖基本性质测定结果壳聚糖分子量对壳聚糖成球的影响分子量较小的C3制备的微球表面 具有明显的疏松多孔结构,而分子量 较大的C1和C2制备的微球表面结 构致密,孔少且小。这可能是因为随 着分子量的增加,壳聚糖分子变长, 微球中壳聚糖分子之间相互结合更加紧密,导致其表面结构致密,多孔 性降低。壳聚糖微球的多孔结构及强度是 影响其作为固定化酶载体的主要因素,分子
8、量较小的C3所成的微球虽 然强度不高,但其表面疏松多孔,而 且可以通过增大其浓度或用戊二醛 交联等方法来增加其强度。所以分子量较小的C3作为制备多孔壳聚糖 微球的材料较好。1 NaOH浓度对壳聚糖成球的影响NaOH浓度对壳聚糖微球的形态和表面 结构具有较大影响:2. 0%的NaOH溶液所成微球表面形 态不规则,球之间容易相互粘结;表面疏 松多孔结构不明显 3. 0%的NaOH溶液中所成微球整体 形态规则,强度较好;表面出现明显的多 孔结构。l这主要是因为壳聚糖在酸性条 件下溶解、碱性条件下沉淀. l在较低浓度的NaOH溶液中,壳 聚糖微球在还未完全沉淀成球 以前就已经塌陷,壳聚糖分子堆 砌在一
9、起,导致所成微球形态不 好、强度较差,表面厚度不均一, 凸凹不平,不能形成良好的疏松 多孔结构; l当NaOH浓度增加时,壳聚糖微 球迅速成形,容易形成厚度均一 、形态较好、强度高的微球,此 时微球表面被撑起,呈现出壳聚 糖自身的疏松多孔结构,因此采 用3. 0%的NaOH浓度较合适。2 壳聚糖浓度对壳聚糖成球的影响v试验发现:壳聚糖浓度为2. 0%时, 虽然微球表面疏松多孔,但是所成 微球形态不好,有轻微拖尾,v当壳聚糖浓度增大到3. 0%时,球 的强度逐渐增大,但拖尾较严重, 球表面比较致密,而且孔也不大, 不利于酶的固定化。这是因为随 着壳聚糖浓度的增加,壳聚糖分子 堆积更加紧密,壳聚糖
10、厚度增加, 从而导致壳聚糖微球表面孔隙减 少。壳聚糖微球表面疏松多孔性 与其表面强度是负相关的,v综合考虑其多孔性及强度,采用2. 5%的壳聚糖浓度较合适。3 凝结液中处理时间对壳聚糖成球的影响试验结果表明:将壳聚糖微球在3. 0%的NaOH 溶液中分别放置3h、5h、7h所成壳聚糖微球 的表面结构、形态均无明显差异,因此将壳聚 糖滴加到凝结液中处理3h是较合适的。这可能 是因为超过3h以后,壳聚糖胶体微滴已经在凝 结液中凝结并稳定成形,壳聚糖微球变的不透 明,再延长其在凝结液中的处理时间对成球效 果意义不大。试验发现:以上因素对壳聚糖内 部结构影响不大,均如y右图所 示,右图是在本试验最佳条
11、件下 所成壳聚糖微球的表面结构的 SEM照片,最佳条件为:2. 5%的 C3、乙酸乙酯加入比例为120 、3. 0%NaOH、凝结时间为3h 。这可能是外部环境因素很难 作用于壳聚糖微球内部,使得壳 聚糖微球内部保持了壳聚糖本 身所具有的疏松多孔结构的缘 故。 由此可见本试验中所制备壳聚 糖微球内部结构疏松多孔,较适 合作为固定化酶的载体。4 壳聚糖微球内部结构结论:l当采用分子量较小(如44. 84万)的壳聚糖、 2. 5%的壳聚糖浓度、3. 0%的NaOH凝结液 中处理3h时,能制备疏松多孔结构和较好形 态的壳聚糖微球,为制备壳聚糖微球作为固 定化酶的载体提供了理论依据。l目前关于影响壳聚
12、糖微球多孔性的研究较 少,关于采用不同分子量的壳聚糖混合物及 其它制备疏松多孔壳聚糖微球方法均还有 待尝试。壳聚糖固定化酶的制备壳聚糖在进行酶固定以前,一般需进行预处理: 先用戊二醛作为交联剂,Span-80作为乳化剂,控制壳聚糖 与戊二醛的比例以及交联时间等条件,用微乳法制备壳聚 糖微球 再以壳聚糖微球作为载体固定所需酶类壳聚固定化酶的制备方法主要有物理吸附法和化学交联法两 种: 物理吸附法就是控制溶液pH等条件,让壳聚糖和酶在一定 温度下充分振荡一段时间,使酶通过物理吸附作用固定在 壳聚糖上。 化学交联法即是先借助于一些方法,在载体上引进一活泼 基团,然后,此活泼基团再与酶分子上的某一基团
13、反应,形成 共价键交。应 用1医药领域 (1)固定化脲酶(2)固定化胰蛋白酶(3)固定化磷酸酯酶(4)固定化葡聚糖酶(5)固定化凝血酶(6)固定化脂肪酶2 环保领域3 生物传感器壳聚糖作为酶固定化载体已得到广泛应用,但 人们对壳聚糖及其衍生物作为酶固定化载体 的研究并没有停止,以期能寻找到更好的固定 化方法、更好的交联试剂,使固定化反应条件 更加温和,所制得的固定化酶的活性保持更高 。在不久的将来,以壳聚糖及其衍生物为载体 的酶固定化方法必将得到更大发展。我国自主开发成功固定化酶技术 v “十五”国家科技攻关计划“纳米材料技术及应用开发”延续项目纳米结 构固定化酶组装技术的开发，日前在京通过了
14、中国石油和化工协会、中 国钢协粉末冶金协会共同组织的专家验收。该成果可望使我国摆脱依赖 进口载体生产固定化青霉素酰化酶催化剂的被动局面，促进我国固定化 酶技术提升和抗生素产业可持续发展。 v华东理工大学郭杨龙教授、卢冠忠教授与北京化工大学何静教授等开发 出具有自主知识产权的低成本的纳米结构高分子聚合物载体合成新技术 ，并建成每年6吨的固定化青霉素酰化酶催化剂生产装置。所生产的纳 米结构固定化青霉素酰化酶催化剂应用于年产500吨6-氨基青霉烷酸(6- APA)生产装置上，固定化青霉素酰化酶的表观活性达775单位/克，成本 比进口载体降低30%以上。研究人员还应用仿生固定化酶概念将猪胰脂 肪酶分子固定于纳米结构内孔表面，针对不同尺寸以孔口接枝或接枝物 种原位聚合等方式进行孔口尺寸改造，建成年产10吨纳米结构仿生固定 化脂肪酶催化剂生产装置。产品用于500吨/年生物柴油生产装置上，植 物油脂交换固定假丝酵母酶的活性提高了5倍，转化率达92%。据介绍 ，该项目共申请了包括1项国际发明专利在内的9项发明专利，形成了较 完整的自主知识产权体系v
