[生物化学]第七章 吸光光度法(1)

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1、第七章 吸光光度法Spectrophotometry7.1 概述吸光光度法：基于物质对光的选择性吸收 的分析方法，又称分光光度法 。属于分子吸收光谱分析方法基于外层电子跃迁吸收光谱 发射光谱 散射光谱7.2 吸光光度法基本原理1 物质颜色和其吸收光关系单色光、复合光、光的互补 单色光复合光光的互补单一波长的光由不同波长的光组合而成的光若两种不同颜色的单色光按一定的 强度比例混合得到白光，那么就称 这两种单色光为互补色光，这种现 象称为光的互补。蓝黄紫红绿紫黄绿绿蓝橙红蓝绿 射 线x 射 线紫 外 光红 外 光微 波无 线 电 波10-2 nm 10 nm 102 nm 104 nm 0.1 c

2、m 10cm 103 cm 105 cm可 见 光物质的颜色与光的关系完全吸收完全透过吸收黄色光光谱示意表观现象示意复合光当光束照射到物质上时，不仅发生吸收 或透射现象，还会产生反射、散射。 界面 反射 损失入射光束透射光束界面 反射 损失溶液散 射损失如被照射的是均匀溶液，则光的散射可以忽 略。 光的波粒二象性波动性粒子性， E光的折射光的衍射光的偏振光的干涉光电效应E：光子的能量（J） ：光子的频率（Hz） ：光子的波长（cm） c：光速（2.99791010 cm.s-1） h：Plank常数（6.625610-34 J.s ）物质对光吸收的本质一束光能量分子+h (原子)M + h =

3、 M* (基态) (激发态) 分子( (原子)(离子) )基态能级1能级2能级3h2(E)h332h11不同的物质微粒由于结构不同而具有不同的量子化能级 ，其能量差也不相同。仅当照射光光子提供的能量(h)与被照 物质的基态与激发态能量之差EE相等时才能发生吸收。所以 物质对光的吸收具有选择性。E=E2-E1=h物质或 溶液S2S1S0hAhhh分子内电子跃迁带状光谱纯电子能态间跃迁S2S1S0S3 hE2E0E1E3锐线光谱A原子分子(a)(b)(c)(d)220 240 260 280 nm A0000(a) 联苯(己烷溶剂) ；一些典型的紫外-可见吸 收光谱(b) 苯(己烷溶剂) ；(c)

4、 苯蒸汽；(d) Na蒸汽。定性分析与定量分析的基础定性分析基础定量分析基础物质对光的选择吸收不同物质吸收光谱不同AB A在一定条件下，物质对光的 吸收与物质的浓度成正比。AC增 大相同物质吸收光谱相同吸收光谱或吸收曲线(absorption,spectrum)固定被测物质的浓度和吸光厚度， 在不同的波长处测定其吸光度。以吸光 度为纵坐标，以测定波长为横坐标作图 ，即为吸收曲线。吸收光谱曲线：物质在不同波长下吸收光的强度大小A 关系最大吸收波长 max：光吸收最大处的波长2 一些基本名词和概念 max对比度( ):两有色络合物 最大吸收波长( MRmax) 之 差 吸收曲线的讨论：（1）而对于

5、不同物质， 它们的吸收曲线形状和 max不同。（2）吸收曲线可以提供物质 的结构信息，并作为物质定性 分析的依据之一。（3）同一种物质对不同 波长光的吸光度不同。不 同浓度的同一种物质，其 吸收曲线形状相似max不 变。（4）不同浓度的同一种 物质，在某一定波长下吸 光度 A 有差异，在max处 吸光度A 的差异最大，所 以测定最灵敏。此特性可 作为物质定量分析的依据 。1729年，Bouguer首先发现物质对光的吸收 与吸光物质的厚度有关。 1760年他的学生Lambert更明确地指出：如 果溶液的浓度一定，则光的吸收程度与液层的 厚度成正比，这个关系称为朗伯定律。表示为 ： 一、吸光度(a

6、bsorbance)入射光 I0透射光 Ib3 朗伯-比尔定律Ab1852年，Beer指出：光的吸收与吸光 物质的数量有关；如吸光物质溶于不吸 光的溶剂中，则吸光度与吸光物质的浓 度成正比。即当单色光通过液层厚度一 定的有色溶液时，溶液的吸光度与溶液 的浓度成正比。这个关系称为比尔定律 。式中c：有色溶液浓度 k2：比例常数Aca-为吸光系数，单位为 L/g cm, b单位cm, c单位g / L()-为摩尔吸光系数，单位为 L/molcm, c单位为mol/L两项合并得：朗伯-比尔定律是吸光物质在特定波长和溶剂的情况下 的一个特征常数，数值上等于1mol/L吸光物 质在1cm光程中的吸光度，

7、是吸光物质吸光能 力的量度。它可作为定性鉴定参数，也可反 映方法灵敏度。（1）吸收物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数；（2）不随浓度c和光程长度b的改变而改变，在温度和波长等条件一定时， 仅与吸收物质本身的性质有关，与待测物浓度无关；（3）同一吸收物质在不同波长下的值是不同的。在最大吸收波长max处的摩尔吸收系数max表明了该吸收物质最大限度的吸光能力，也反映了光度法测定该物质可能达到的最大灵敏度。 灵敏度表示方法-（4）可作为定性鉴定的参数；（5）物质的吸光能力的度量max越大表明该物质的吸光能力越强，用光度法测 定该物质的灵敏度越高。 105：超高灵敏；吸光光度法中，一般要求 104 （

8、6） 在数值上等于浓度为1 mol L-1、液层厚度为1cm 时该溶液在某一波长下的吸光度。 与a 的关系式中M为物质的摩尔质量。经研究：当一束单色光，通过任何均匀、非散 射的固体、液体或气体介质时，其吸光度与吸 光厚度和物质浓度成正比。二、透光度T(transmittance)吸光度与透光度的关系T ： 透光度A： 吸光度1.00.50ACA100500T %TT = 0.0 %A = T = 100.0 %A = 0.0A = 0.434T = 36.8 %三、吸光度的加和性：在多组分体系中，如果各种吸收物质之间 没有相互作用，体系的总吸光度等于各组分吸 光度之和。四、工作曲线工作曲线又称

9、标准曲线或较正曲线。绘 制时先配制一系列具有不同浓度吸光物质的 标准溶液，然后在确定的波长和吸光厚度(光 程)等条件下，分别测量其吸光度。以吸光度 A为纵坐标，标准物质的浓度c为横坐标作图，即为工作曲线。AccxAx吸光度与光程的关系 A = kbc 光源检测器0.00吸光度检测器L样品光源0.22吸光度光源检测器0.44吸光度L样品L样品吸光度与浓度的关系 A = kbc L2L1吸光度0.00光源检测器吸光度0.22光源检测器L1吸光度0.42光源检测器L2例: 1.有一溶液,在max=310 nm处的透光率为87%，在 该波长处时的吸光度为多少？ 解：T87；AlgTlg870.06 2

10、.已知苯胺的max=280 nm, =1430,有一含苯胺的 水样，在1 cm比色皿中测得吸光度为0.52，求 该水样中苯胺的含量。（以mg/L表示) 解:3.某有色化合物的0.0010%水溶液,在510 nm处,用 3 cm比色皿测得吸光度为A=0.57,已知摩尔吸光系 数为2.5103 L/molcm,求该有色配合物的摩尔质 量。 解：4 偏离比耳定律的原因1. 现象标准曲线法测定未知溶液的浓度时，发现：标准曲线常发生弯曲（尤其当溶液浓度较高时），这种现象称为对朗伯比耳定律的偏离。2. 引起偏离的因素（两大类）（1）物理性因素，即仪器的非理想引起的；（2）化学性因素。（1）物理性因素：LB

11、定律基本假设：入射光为单色。实际上仪器发出的入射光是波长范围较 窄的光带组成的复合光。设由1和2两束光组成，其吸光度分别 为A和A”。对1对21 非单色光引起的偏离测定时入射光的总强度为(I0+I”0）,透射光 的总强度 为(I1+I2)，因此所得吸光度值为：将I1和I2代入得：可见，1=2 时，A=bc，A与c成直线关系。 如果12 ，A与c则不成直线关系。 1，2 差别 愈大，A与c之间的线性关系偏离也愈大。尽量选取吸光度随波长变化不大的谱带进 行测量(A)，则A随波长变化小，的变化小， 引起的偏离小，A与c基本为直线。若选用谱 带B的复合光进行测量， 的变化大，A与c的 线性关系也差。那

12、么，我们如何选用入射光波长？选取谱带A处作 入射波长，还可保证 吸光度最大，灵敏度 最好。2、非平行入射光引起的偏离朗伯-比尔定律要求入射光平行垂直入射 。若入射光束为非平行光，可能导致工作曲 线产生正偏离。b b3、介质不均引起的偏离朗伯-比尔定律要求吸光物质溶液：均匀的 、非散射的。若溶液不均，如产生胶体或浑浊 ，当入射光通过该溶液时，除了一部分光被吸 收外，还有一部分因散射而损失，使实测的吸 光度偏高，从而使工作曲线产生正偏离。(2) 化学性因素L-B定律的基本假设要求溶液中吸光质点是独立的，彼此间无相互作用，因此稀溶液能很好地服从该定律。高浓度时(0.01 mol/L)，由于吸收组分粒

13、子之间的平均距离减小，相互影响邻近粒子的电荷分布，使吸光能力发生变化。即改变物质的摩尔吸光系数()。其相互作用的程度与浓度有关，浓度增大，吸光度与浓度之间的关系偏离线性关系越大。所以一般认为比尔定律仅适用于稀溶液。1、高浓度引起的偏离Cr2O72- + H2O = 2H+ + 2CrO42- （橙色） （黄色）L-B中浓度(c) 应指吸光物质的平衡浓度， 即吸光型体的平衡浓度。实际常用吸光物质的 分析浓度。只有当平衡浓度等于或正比于分析 浓度时，其吸光度才符合郎比定律。但溶液中吸光物质常因缔合、离解、互变 异构，络合物的逐级形成，以及与溶剂的相互 作用等而形成新的化合物或改变吸光物质浓度 ，这

14、些都将导致偏离比尔定律。如2、化学反应引起的偏离7.3 吸光光度分析方法及仪器1、目视比色法一、比色法c c1 1c c2 2c c3 3c c4 4比色管比色管c cx x以眼睛比较溶液颜色的深浅以测定物质含量的方 法，称为目视比色法。常用的目视比色法是标准 系列法优点：设备简单，操作简便，不要求有色溶液 服从郎比定律，广泛用于准确度要求不高的常 规分析中。 缺点：准确度不高，如溶液中存在第二种有色 物质，无法测定。许多有色溶液不稳定，标准 系列不能久存，经常用时配制，麻烦。2、光度计及基本部件光电比色法：使用光电比色计测定溶液，进行定 量分析的方法 分光光度法：使用分光光度计测定溶液，进行定 量分析的方法两种方法的测定原理相同，只是获得单色 光的方法不同，前者用滤光片，后者用棱镜或 光栅等单色器。由于两者均基于吸光光度测定，统称为光 度分析法。国产分光光度计类型主要有：72、721、 722和725型。其主要部件和光路示意图如下。光源单色器吸收池检测系统参比池紫外可见分光光度计1.光源；2.滤光片；3.聚光镜；4.狭缝；11.反射镜；5.准 直镜；6.光栅；7