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1、http:/ -1- 应用实时荧光定量应用实时荧光定量RT-PCR检测宫颈癌及其外周血中检测宫颈癌及其外周血中 VEGF 表达的研究表达的研究 刘素梅，赵淑萍 青岛大学医学院附属医院，青岛（266003） E-mail： 摘摘 要： 目的要： 目的 研究血管内皮生长因子在宫颈癌患者癌和癌旁组织及外周血循环细胞中的表 达情况，分析其在肿瘤生长与转移中的作用。方法方法 采用基于 TaqMan 探针技术的实时荧光 定量 RT-PCR 法检测了 50 例宫颈癌患者癌及癌旁组织和 40 例正常宫颈组织标本中 VEGF mRNA 的表达情况及其对应的外周血中的 VEGFmRNA 表达，分析其与临床病理参数
2、之间 的关系。结果结果 宫颈癌组织及癌旁组织中 VEGF mRNA 的表达水平无明显差异，但均与正 常宫颈组织的表达水平差异有显著性；宫颈癌组织中 VEGF mRNA 的表达与肿瘤的组织学 类型无明显的相关性；而与肿瘤的临床病理分期、病理分化程度、淋巴结转移、肿瘤直径、 深肌层浸润间均呈显著的正相关。宫颈癌患者外周血中 VEGF 的表达明显高于对照组水平， 与淋巴结是否转移密切相关，但与其他临床病理参数无关。结论结论 实时荧光定量 RT-PCR 可以敏感且特异性的检测出宫颈癌组织及外周血中 VEGF mRNA 的表达，且方法准确可靠, 操作方便，在肿瘤的微转移的诊断监测方面有一定的应用价值。V
3、EGF 有可能成为治疗恶性 肿瘤的一个潜在的分子靶点。 关键词：关键词：实时荧光定量 RT-PCR；血管内皮生长因子；宫颈肿瘤 血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor ,VEGF)是迄今鉴定出来的最重要的血管生成因子，具有促进血管内皮细胞分化、增生、迁移和浸润的作用。它与肿瘤的生长、浸润和转移有密切关系，并与肿瘤生物行为相关 1。子宫颈癌在妇科恶性肿瘤中居首位,其浸润和转移是患者治疗失败死亡的主要原因。 如何在早期发现其踪迹并控制其复发和转移是最常见的棘手问题。关于 VEGF 在子宫颈癌组织中的表达和意义越来越受到国内外学者的关注。本研究选择特异
4、性较常规 RT-PCR 更好的实时荧光定量 RT-PCR(real time fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR)技术定量地对 VEGFmRNA 在宫颈癌患者组织和外周血中的表达情况及意义进行研究，以探讨其临床应用价值。 1. 材料和方法材料和方法 1.1 资料来源资料来源 所有标本均来自 2004 年 3 月-2005 年 12 月我院妇科手术治疗患者，包括 50 例宫颈癌患者及 40 例子宫肌瘤行全子宫切除术患者。患者年龄 31-72 岁，中位年龄 52.2 岁。宫颈癌患者按 FIGO 标准分期，Ib 期 15 例，IIa 期 22 例，IIb 期 1
5、3 例; 按 WHO 组织学类型分型：腺癌 12 例，鳞癌 34 例，腺鳞癌 4 例；病理分化程度：高分化 6 例，中分化 22 例，低分化22 例。 术后证实无淋巴结转移 20 例， 淋巴结转移 30 例。 肿瘤直径4cm 28 例， 肿瘤直径4cm 22 例。癌组织局限于浅肌层以内 28 例，有深肌层浸润者 22 例。所有病例术前均未经任何治疗，临床资料完整。 1.2 标本采集标本采集 手术切除的宫颈癌标本离体后，立即于无菌状态下先取距肿瘤边缘 1-2cm 的癌旁组织,然后沿肿瘤边缘切取生长活跃的瘤组织,将所取组织切成 3-5 mm 的组织小碎块装入冻存管内并立即放入液氮中,随后将其转入-
6、70冰箱内保存。同时采取该患者 5ml 血贮存于肝素抗http:/ -2- 凝管中。采用同样的方法取得并保存作为对照的正常宫颈组织及外周血。 1.3 主要试剂和仪器主要试剂和仪器 德国 Roche Diagnostics 公司的 Lightcycler 荧光 PCR 仪， RNA 提取试剂盒 Trizol Reagant为美国Gebco公司产品,引物、 荧光探针由上海生物化工有限公司合成(序列见表1)， TAKARA Exscript TM RT-PCR Kit（Perfect Real Time）购自大连宝生物工程有限公司。 表 1 引物和探针序列 名称 序 列 Tm 值 扩 增 片 断（b
7、p） 5-AAGATCCGCAGACGTGTAAATGTT-3 60 引物 5-CGGCTTGTCACATGCAAGTA-3 60 100 VEGF 探针 5-GCAAGGCGAGGCAGCTTGAGT- 3 60 100 5-CTTAGCACCCCTGGCCAAG -3 60 引物 5-GATGTTCTGGAGAGCCCCG -3 60 150 GAPDH 探针 5-CATGCCATCACTGCCACCCAGAAGA-3 60 150 1.4 方法方法 1.4.1 RNA 提取提取 按试剂盒说明提取组织和外周血中有核细胞的总 RNA, 用紫外分光光度计对 RNA 在260nm 和 280nm
8、 下的吸光度 A260 和 A280 进行定量，计算 OD260/OD280，所有标本的比值要求在 1.751.95 之间。低于此值者表明其含有蛋白质杂质,用氯仿重新提纯。 RNA 样品-70保存备用。 1.4.2 荧光定量荧光定量 RT-PCR 的检测的检测 试验采用相对定量法检验基因的表达变化， 经可行性试验验证目的基因与内参的扩增斜线差值小于 0.1，可以应用CT 法进行定量分析。按试剂盒要求，吸取 2l 总 RNA，逆转录成 cDNA。 逆转录条件为:42 15min,95 2min。 荧光定量 RT-PCR 反应体系: Premix Ex Taq TM（2）10.0 l、 PCR F
9、orward Primer（10 M）0.4 l、PCR Reverse Primer（10M）0.4 l、 荧光探针溶液 （4M） 0.8 l、 ROX Reference Dye （50） 0.4 l 、 DNA 模板 （cDNA溶液）2.0 l、 dH2O（灭菌蒸馏水）6.0 l。整个加样过程在冰上进行，将反应液分装入毛细管后 3000 转离心 15s，然后放入 Light Cycler 中进行 Real Time RT- PCR 反应。反应条件为：95 10S、95 5S、60 34S，共 40 个循环。 GAPDH 作为内参照与 VEGF 同时行 PCR 反应， 并于反应结束后一起分
10、析结果。 用 Light Cycler 荧光定量 PCR 扩增仪进行 PCR 反应，在 PCR 反应的同时, 每扩增 1 次循环, 检测 1次 PCR 产物量(荧光强度变化)。所有的反应产物均被 Light Cycler 扩增仪收集, 并储存于其附件(电脑)及相应的分析软件中。按照下列公式计算样本中 VEGFmRNA 的相对表达量2：CT（目的基因）=目的基因 CT-内对照基因 CT，CT=CT（目的基因）-CT（标准值） ， 目的基因的相对总量为 2-CT。 CT 值是指每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数，CT 值与 VEGFmRNA 的表达水平呈负相关，即 CT 值增加，
11、表示VEGFmRNA 水平下降。 http:/ -3- 1.5 统计学处理统计学处理 通过 SPSS10.0 软件进行相关统计学分析，P0.05 具有统计学意义。 2. 结果结果 2.1 VEGFmRNA 在正常宫颈组织、宫颈癌组织及癌旁组织中的表达在正常宫颈组织、宫颈癌组织及癌旁组织中的表达 采用相对定量法 2-CT 公式比较正常宫颈组织、 宫颈癌组织及癌旁组织中 VEGFmRNA的表达量， 以正常宫颈组织 VEGFmRNA 的表达量作为标准， 在此基础上比较宫颈癌组织及癌旁组织中 VEGFmRNA 的相对表达量，见表 2，图 1、2。统计学分析表明三种组织中VEGFmRNA 的表达量有显著
12、性差异（P0.05） 。VEGFmRNA 在宫颈癌及癌旁组织中的表达量明显高于宫颈正常组织（P0.05） ，但宫颈癌组织中 VEGFmRNA 表达量与癌旁组织的表达量未见明显差异（P0.05） 。 表 2 VEGFmRNA 在不同组织中的表达情况 组别 例数 Ct 值 Ct 2 -Ct P 值 正常宫颈 40 12.721.47 0.001.47 1.00(0.33-2.99) 宫颈癌 50 10.231.10 -2.491.10 3.59(2.62-12.04) P0.05 P0.05 P0.05 P0.05 P0.05 P0.05 3. 讨论讨论 VEGF是一种高度特异性、选择性的血管内皮
13、细胞有丝分裂原，能特异性刺激血管内皮细胞增殖， 能促进血管生成， 增强血管的渗透性， 并与多种肿瘤的复发转移及预后密切相关。实时荧光定量PCR(real time fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR)技术是近两年在临床上广http:/ -6- 泛应用的一种基因定量检测技术3。在肿瘤诊断上，FQ-PCR技术不仅能有效检测基因的突变，而且能够准确检测出肿瘤相关基因的表达量，据此进行肿瘤的早期诊断、分期、分型以及发现早期转移、判断预后。应用FQ-PCR检测外周血中的肿瘤标志物数量及原癌基因异位导致融合基因的形成量都为临床早期诊断、判断疗效、制订治疗方案提供更为可
14、靠的依据，因此此实验为验证应用FQ-PCR技术来监测VEGF mRNA的基因表达能否作为判断肿瘤微转移方法的可行性。 与其他实体肿瘤一样，宫颈癌的生长、转移和预后均与血管生成有密切的关系。关于宫颈癌与 VEGF（VEGF-A）的研究较多，而选择实时荧光定量 RT-PCR 技术定量的研究较少。已有文献报道4，5 血清 VEGF 水平与多种恶性实体瘤如卵巢癌、 结直肠癌等恶性行为及预后有关。有研究发现6 从正常宫颈上皮到原位癌再到浸润癌的发生发展过程中，VEGF 表达进行性升高。Lee 等7的研究表明 VEGF 具有促进宫颈鳞癌血管形成的作用。本研究应用实时荧光定量 RT-PCR 技术对 50 例
15、宫颈癌患者癌及癌周组织和外周血及 40 例正常对照定量检测VEGF mRNA 水平，结果显示宫颈癌患者癌及癌周组织和外周血中 VEGF mRNA 表达水平明显高于正常对照，说明 VEGF 在宫颈癌的发生发展中扮演者重要角色。 宫颈癌主要通过淋巴途径转移， 临床多以有无淋巴结转移来评估预后及指导治疗， 因而早期预测和发现有无淋巴结转移具有重要临床意义。Cheng 等8报道，宫颈癌有盆腔淋巴结转移者VEGF表达显著高于无盆腔淋巴结转移者，VEGF过度表达容易发生盆腔淋巴结转移。本组中有盆腔淋巴结转移者其癌组织及外周血中VEGF 阳性表达水平显著高于无盆腔淋巴结转移者，说明VEGF 表达与盆腔淋巴结
16、转移密切相关，VEGF 过度表达者更易发生盆腔淋巴结转移，与文献结果相符。至于这种相关性是因VEGF 直接促进淋巴管的新生还是其他途径尚不清楚。另外, 本研究发现组织中VEGF的表达与宫颈癌细胞分级有相关性，即VEGF 表达随肿瘤细胞分级的增高而增强， 同时发现低分化组VEGF的表达显著高于高分化组，表明VEGF与肿瘤的恶性程度相关。已有研究表明，宫颈癌组织中VEGF 过度表达与肿瘤大小、深层间质浸润、淋巴管癌栓、宫旁浸润和盆腔淋巴结转移有关，认为VEGF 可能是一个有价值的宫颈癌预后指标。在本组进一步分析宫颈癌组织中VEGF mRNA水平与不同临床病理指标的关系也发现，深肌层浸润、肿瘤直径大于4
