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1、上海水产大学硕士学位论文斜带石斑鱼哈氏弧苗研究姓名：陈献稿申请学位级别：硕士专业：水产养殖指导教师：吴淑勤;石存斌2003.6.1陈献稿上海水产大学硕士学位论文中文摘要斜带石斑鱼哈氏弧菌疫苗研究摘要斜带石斑鱼( E p i n e p h e l u sc o i o i d e s ) 为海水名贵鱼类，是我国南方地区网箱养殖鱼类主要品种之一，但养殖过程中死亡率较高，其中弧菌病引起的溃疡病是一种常见病和多发病，常造成严重的经济损失。作者从自然患病斜带石斑鱼肝脏中分离到一株致病菌，编号为E c G Y 0 2 0 4 0 1 。用该株病原菌人工感染斜带石斑鱼，实验鱼出现尾鳍溃烂、体表溃疡等与自然
2、发病相似的症状。经细菌快速鉴定仪鉴定为弧菌，细菌学常规检测结果符合哈氏弧菌的特征；通过1 6 Sr R N A 测序并经序列匹配分析，确认为弧菌属哈氏弧菌( V i b r i oh a r v e y i ) 。经查新，为在中国大陆首次从斜带石斑病鱼中分离到哈氏弧菌。腹腔注射攻毒，按照R e e d M u e n c h 法计算，该菌对斜带石斑鱼的半数致死剂量( L D 5 0 )为2 7 1 0 0 c f u g 鱼体重。作者采用温酚法从哈氏弧菌E c G Y 0 2 0 4 0 1 株菌体提取了粗脂多糖( 粗L P S ) ，采用硫酸铵分级盐析提取了其粗胞外产物( 胞外产物A ) 。
3、此外，对粗L P S 和胞外产物A 、提纯的胞外产物和脂多糖( L P s ) 的一些特性进行了分析。结果表明，胞外产物A ( 4ug g ) 对斜带石斑鱼有致死作用，而注射粗L P S ( 4pg g 1 时斜带石斑鱼无异常；胞外产物A 对小白鼠红细胞溶血作用最强，对人O 型血红细胞无溶血作用，对斜带石斑鱼有溶血作用；1 琼脂平板法检测胞外产物A 具有淀粉酶、酪蛋白酶、脂肪酶活性。这些结果显示有可能可通过接种粗E C P 疫苗预防弧菌病；制各粗E C P 疫苗时应该对胞外产物A 进行灭活，而粗L P S陈献稿上海水产大学硕士学位论文中文摘要在制备疫苗可以不用灭活。纯化的E C P 、L P
4、S 按l a e m m l i 法不连续S D S P A G E ，前者经考马斯亮蓝R 一2 5 0 染色，显示为3 条带，分子量依次约为3 3 K D 、2 3 K D 、2 0 K D 其中的3 3 K D 与李国诰等( 2 0 0 2 ) 从鲨鱼弧菌( 即哈氏弧茵) 分离、纯化到一条主带为3 3 K D ( 丝氨酸蛋白酶)致；后者经氨银法染色，为片状快速迁移带，与报道的脂多糖相似。为研制有效的预防斜带石斑鱼哈氏弧菌病疫苗，作者分别制备了福尔马林灭活的全菌疫苗( 简称F K C 苗) 、粗E C P 苗、粗L P S 苗。安全性试验结果表明，F K C 苗5 0 X1 0 7 c f
5、u g ( 1 0 倍于实际免疫接种剂量) 、粗L P S 苗6 0ug g ( 1 5 倍于实际免疫接种剂量) 、粗E C P 苗1 0 pg g ( 1 2倍于实际免疫接种剂量) 体重的剂量注射接种，对斜带石斑鱼安全可靠。考虑到养殖生产中实际情况，采用不同途径和方法，对F K C 苗、粗E C P苗、粗L P S 苗的免疫效果进行比较试验。结果表明：1 ) 哈氏弧菌F K C 苗、粗L P S 疫苗、粗E C P 疫苗均能刺激斜带石斑鱼幼鱼产生体液免疫应答，获得免疫保护效果，初步证实了采用疫苗防治斜带石斑鱼弧菌病是一条可行方法；2 ) 三种疫苗的免疫效果顺序依次为F K C 苗 粗E C
6、P 苗 粗L P S苗，注射途径效果好于浸泡免疫，其中F K C 苗采用腹腔注射的方法获得的免疫保护力最强( 7 9 ) ；3 ) 粗E C P 苗、粗L P S 苗等亚单位疫苗采用浸泡法，在加强免疫时也显示出较好的免疫保护作用；4 ) 利用莨菪碱作为增效剂，可显著提高哈氏弧菌F K C 苗浸泡免疫时保护效果( 卡方检验，P c r u d eE C Pv a c c i n e s c r u d eL P Sv a c c i n e s 。3 ) a f t e rb o o s t e r , e s t u a r yc o dh a db e t t e rp r o t e c
7、t i v ee f f e c t sw i t hs u b c e l l u l a rv a c c i n e s ，b o t hc r u d eE C Pv a c c i n e sa n dc r u d eL P Sv a c c i n e s 4 ) t h e r ew e r es i g f i c a n t l yi n c r e a s ei nR P S ( x2t e s t ，P 粗L P S 苗组( 4 7 ) 。浸泡免疫保护效果顺序为：莨菪碱浸泡F K C 苗组( 6 4 ) 茛菪碱浸泡粗L P S 组( 2 2 ) 直接海水浸泡F K C
8、苗组( 1 2 ) 直接海水粗L P S 苗组( 8 ) 。经S T A T I S T I C A 软件x2 检验，腹腔注射F K C 苗保护率极显著差异于莨菪碱浸泡粗L P S 苗组、直接海水浸泡F K C 苗组、直接海水浸泡粗L P S 苗组、对照组( P 均 粗E C P 苗组( 3 5 ) 粗L P S 苗组( 2 3 ) 。3 8陈献稿上海水产大学硕士学位论文第四章：免疫效果研究表4 6 试验I I 免疫保护效果T a b l e4 - 6P r o t e c t i v ee f f e c to fe x p e r i m e n tI I实验组攻毒鱼数免疫后6 周攻毒累计
9、死亡数累计死亡率相对保护率直接浸泡F K C 苗淡水预处理后浸泡F K c 苗直接浸泡粗L P S 苗淡水预处理后浸泡粗L P S直接浸泡粗E C P 苗淡水预处理后浸泡粗E C P 苗腹腔注射F K c 苗腹腔注射粗L P S 苗腹腔注射粗E C P 苗对照2 31 25 28 07 0艺6 0瓣m霸量5 0 塍 萎4 03 02 01 00组别 G r o u p s图4 - 2 试验I I 攻毒保护结果F i g 4 - 2R e s u l t so fg r o u p e r si m m u n i z e db yd i f f e r e n tr o u t e sa g
10、a i n s t V i b r i oh a r v e y is t r a i nE c G Y 0 2 0 4 0 1i ne x p e r i m e n tI I 比较浸泡保护效果，保护力顺序为：淡水处理后浸泡F K C 苗组( 6 7 ) 直接海水3 9弛钾弘矩俜孙弘踮“弛黔撕鹊n弘6476672坞挖孔船盟船船孙坞踮陈献稿上海水产大学硕士学位论文第四章：免疫效果研究浸泡F K C 苗组( 5 2 ) 淡水处理后浸泡粗L P S 组= 直接海水浸泡粗E C P 组( 5 0 ) 淡水处理后浸泡粗E C P 组( 4 6 ) 直接海水浸泡粗L P S 组( 3 9 ) 。经S T
11、 A T I S T I C A软件x2 检验，注射F K C 苗组保护率极显著差异于对照组( P I o 0 0 4 4 0 0 1 ) ；注射F K C 苗组保护率显著差异于注射L P S 苗组( 0 O I P = O 0 2 1 6 0 0 5 ) ；淡水处理后再海水浸泡F K C 苗组保护率显著差异于对照组( 0 0 1 P = O 0 1 3 3 0 0 5 ) ；其他组之间差异不显著。3 讨论3 。1 疫苗对鱼体的安全性制备预防动物疾病的疫苗最重要的生物学原则是疫苗对防治对象考虑安全和有效。所以，世界上许多国家免疫防治鱼类细菌病大多采用灭活的疫苗，最常用福尔马林灭活方法。美国联邦
12、农业部( U S D A ) 规定商品化鱼用疫苗接种鱼体卜2 周存活率指标要达到9 5 以上。本实验表明，0 3 福尔马林灭活哈氏弧菌F K C 苗5 0Xi 0 7 c f u g 鱼体重( 1 0 倍于实际免疫接种剂量) 、粗L P S 疫苗6 0 ug g 鱼体重( 1 5 倍于实际免疫接种剂量) 、粗E C P 疫苗1 0 ug g 鱼体重( 1 2 倍于实际免疫接种剂量) 安全性均达1 0 0 。3 2 抗体滴度与免疫效果关系试验I 结果表明：腹腔注射F K C 苗保护率极显著好于莨菪碱浸泡粗L P S 苗组、直接海水浸泡F K c 苗组、直接海水浸泡租L P S 茁组、对照组( X
13、2 检验下同，P 均 O 0 1 ) ：注射粗L P S 苗保护率显著高于对照组( 0 O I P = O 0 4 8 8 0 0 5 ) 。试验I I结果表明：注射F K C 苗组的保护率极显著高于对照组( P = 0 0 0 4 4 0 0 1 ) ；注射F K C菌组保护率显著好于注射L P S 苗组( O ，O l P = O 0 2 1 6 0 0 5 ) 。从试验I 和试验I I 中的数据显示，绝大多数组的这些结果从血清学和免疫保护力关系来看，都反映血清抗体滴度和免疫保护力正相关。但对试验I 直接海水浸泡粗L P S 苗组而言，血清抗体滴度和免疫保护力的相关性表现不一致，可能与鱼体
14、个体存在差异性有关。3 3 不同免疫途径的免疫效果对F K C 苗来说，注射途径的免疫保护效果最好，淡水预处理后海水浸泡免疫堕堕塑圭塑查主查堂堡主兰堡堕塞苎塑童：垒蕉鍪墨堑窒一和莨菪碱浸泡免疫两种方法保护效果次之；至于试验I I 的直接浸泡R P S 高于试验l ，可能与所用的剂量有关。对粗L P S 茁来说，试验I 中注射途径效果好于莨菪碱浸泡免疫和直接浸泡。试验I I 淡水预处理后浸泡免疫方法反而比注射途径的好，推测与注射的剂量偏少有关。对粗E C P 苗而言，直接浸泡和淡水预处理后浸泡的方法也比注射途径的好，推测也与注射的剂量偏少有关。有关剂量的确定有待进步研究。3 4 莨菪碱的增效作用
15、在淡水鱼类浸泡免疫研究中，莨菪碱作为增效剂提高疫苗免疫效果，已有许多成功报道( 陈月英等，1 9 9 8 ) 。但迄今为止，在海水弧菌疫苗中加入莨菪碱浸泡海水鱼尚未见报道。作者应用莨菪碱浸泡斜带石斑鱼，试验结果表明，莨菪碱浸泡F K C 苗组保护率莨菪碱浸泡F K C 苗组保护率极显著好于对照组( P = 0 0 0 7 9 0 0 1 ) ；显著高于直接海水浸泡F K C 苗组( 0 O I P = O 0 2 0 9 0 0 5 ) 。莨菪碱浸泡粗L P S 苗组保护率也优于直接浸泡粗L P S 苗组，说明茛菪碱对于海水鱼类浸泡亚单位疫苗免疫也有增效作用。莨菪碱能提高鱼体免疫力，其机理主要
16、是改善鱼体微循环打开细胞通道。为了打开细胞通道，周永灿等( 2 0 0 2 ) 利用超声波技术浸泡免疫：日本N a k a n i s h i等利用连续打孔器刺伤鱼体在伤口愈合前浸泡。但这些方法都有较明显的局限性。市售的莨菪碱成本低廉，在本实验中，F K C 苗加莨菪碱浸泡的免疫保护力达到6 0 以上，展示了莨菪碱作为浸泡免疫佐剂预防海水鱼类弧菌病的应用前最。3 5 淡水预处理的作用为了打开细胞通道，对于淡水鱼类可采用高渗处理的方式，如C r o y 等( 1 9 7 7 )利用高渗免疫预防红大麻哈鱼的弧菌病，得到了良好的试验结果。对海水鱼类采用高渗处理似乎效果不明显。用淡水处理海水鱼类鱼体后再海水浸泡免疫尚未见报道。目前，养殖石斑鱼普遍受寄生虫严重侵害( 杨文川等，2 0 0 1 ；吴灶和等，1 9 9 7 ) 。本试验I I 结果
