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1、!“ 卷 ! 期 !“# 年 $ 月生物工程学报 !“#$%+?,，及 “=“6 体 积 的 “6 ? !) 缓 冲 液，“A#:; 48) B2(! 和 ,A“ C (DE 12聚合酶，以 #6“ 体系 （加 #6“ 灭菌石蜡油） 于 !)仪 （/96， !F 公司） 中扩增 （G/H 变性 “:I7，.“H退火*6J，K,H延伸 /#J， 循环数为 *6； K,H延伸 #:I7） ， 产 物经测序、 电泳鉴定后， 纯化待用。以 3)454(+%-!.# 质粒 （,678） 为模板，利用人结核杆菌 +-!.# 全 长基因的上、 下游引物 !*， !/ 各 “:;， 及 “=“6 体积的 “6
2、 ? !) 缓冲液，6A,:; B2(! 和 , C !LC12 聚合酶，以 #6“ 体系 （加 #6“ 灭菌石蜡油） 于!) 仪 （/96， !F 公司） 中扩增 （G/H变性 “:I7，.“H 退火 /6J，K,H 延伸 “:I7， 循环数为 ,9； K,H 延伸#:I7） ， 产物经测序、 电泳鉴定后， 纯化待用。!“()%*+,$+-,$. 分泌型穿梭表达质粒的构建 将 !) 扩增的信号肽 12 片段用 !“#+!和$% (MIJ%+) F1(） 中。加入 9“ #6:; !4-N 和 “.“ #O 溶菌酶， 冰浴“6:I7。在冰浴中用超声细胞破碎仪进行超声破菌， 功率为 *66P，
3、每次时间为 ,#J， 共 . 次。室温下“,666M=:I7 离心 ,6:I7。收集上清和沉淀， 沉淀悬浮 于 ,66“ 裂解液 中。 Q ,6H存放。!“/,0,+$1*2 及蛋白密度测定-1-%! 脱脂奶粉封闭， 抗人结核杆菌+-!.# 单克隆抗体 （“R,666） 以及羊抗兔 S8 (MIJ%+) F1(） 中， 终止显色反应。=结果=“!重组质粒的鉴定=“!“!限制性内切酶分析：挑选阳性克隆， 抽提质 粒， 分别用 $%9:!：(#$-./ 44)# ?A ($2-)； B：456789:8;9:#图 B;9:M+) ,1 ;9: 9:8;9:*图 E;9:M+),1 ;9: (#$-
4、./ 44)#I!：BNN34 /.*；!：;9: ?A ($2-)；IB：!NN34 /.*!“!重组 #$%9:， FBO诱导 EN2#-后破菌。用 9?98:A7P 方法鉴定 ;9:#- *+,23#-.-) +,-./“-012 小鼠进行肌肉免疫， 然后用结核杆菌 %JDKL 对其进行攻击后， 小鼠体内 M?=IM;=型特异性细胞毒性反应占优势， 并且该特异性 M 细胞克隆可将其免疫保护作用转移给无保护作用的试验小鼠。%1/6;+),3B 1,#：N10Y +31- 6463-*+ +B/),;B.01*3* /7 6 :06* +#8 ?%$ 456*.5“2 ?2)AB%?A A0C C?BCA(DC EB2F1BG2A(? 0%AAHC CIEBC(2) EH1J(K EL+3生物工程学报Z= 卷
