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1、高通量技术在肠道微生物宏基因组学研究中的应用诺贝尔奖获得者Joshua Lederberg认为，人 是一种由自身细胞和肠道菌群组成的“超级生物体“。人 体肠道菌群编码的基因组可被视为“人的第2基因组” ，它们参与人体的营养、代谢和免疫过程，是影响人体 健康最重要的因素之一。由此对肠道微生物宏基因组学的研究成为当今的热 点。高通量测序技术具有诸多优越性，使研究者不仅能 够深入分析肠道菌群结构和多样性，还能结合其它“组 学”技术进一步了解肠道微生物的基因功能和代谢途 径。概述概述概述概述人体肠道为微生物提供了良好的栖息环境，共 生微生物多达1000 多种，成人肠道内微生物的数量大 约是101210
2、14 个， 不仅远远大于体表其它微生物的 数量，而且是人体自身细胞数的10 倍。从基因层面上看 ， 人体自身的基因组大约携带了2.5 万个基因，而人体 肠道微生物编码的基因总数约是人自身基因总数的150 倍,人的基因组与人体肠道微生物宏基因组相互协调， 和谐一致，共同作用于人体的免疫、营养和代谢过程.概述概述概述概述保证了人体的健康很多研究表明肠道菌群与宿 主的健康状况息息相关， 肠道菌群影响宿主的代谢显 型，营养物质的产生和吸收以及调整和改善宿主的免疫 系统。人的健康状况发生变化， 肠道微生物的组成结 构就会发生变化； 肠道微生物的组成变化同样也会导 致人体的健康状况的改变。肠道菌群结构的紊
3、乱与各种 疾病，特别是饮食不当导致的肥胖、糖尿病、冠心病、 结肠癌等的发生具有密切的关系。此外，不同的人具有 不同的肠道菌群结构，饮食、药物以及环境因素也影响 人体肠道菌群的组成。由此，肠道菌群结构可以精确反 映人体的健康状况。随着高通量测序技术的发展， 科 学家们对肠道微生物宏基因组进行全面地测序分析， 并对肠道微生物的生理功能进行深入解析，这为以肠道 菌群为靶点，通过改变膳食结构和营养摄入来预防和治 疗各类慢性疾病带来了全新的思路和方法。本文结合最 新研究成果， 重点介绍高通量测序技术在肠道微生物 宏基因组学研究中的优越性， 并讨论今后的研究重点1987 年，以双脱氧核苷酸末端终止法（ S
4、anger法）为代表的第1 代测序技术诞生13，Sanger 法以 其高准确度（99.999%）以及较长的读长（1 000 bp）在人类基因组计划（Human genome program， HGP）中发挥了巨大作用。然而制约于成本高，通 量低以及测序速度慢的缺点Sanger 法已不能满足于宏 基因组测序分析。随后，高通量测序技术登上基因组学研究的 舞台。高通量测序技术特点及用于宏基因研究优越性高通量测序技术特点及用于宏基因研究优越性高通量测序技术特点及用于宏基因研究优越性高通量测序技术特点及用于宏基因研究优越性高通量测序技术是目前基因组学研究中应用最广泛的 测序技术， 它有效避免了Sange
5、r 法繁琐的克隆过程， 具有通量高，速度快，成本低等优点。目前， 主流的高通量测序技术主要包括454 公司 的GSFLX 测序平台、Illumina 公司的Hiseq 和 Miseq 测序平台以及Life Technologies 公司的Ion torrent PGM 和Ion proton 测序平台，3 大公司测序平 台的比较结果如表1 所示。高通量测序技术特点及用于宏基因研究优越性高通量测序技术特点及用于宏基因研究优越性高通量测序技术特点及用于宏基因研究优越性高通量测序技术特点及用于宏基因研究优越性以往人们对肠道微生物的研究主要依赖于传统微生 物分离纯培养技术， 然而实验室复原微生物区系时
6、， 对厌氧微生物获得的信息量是有限的；研究者在肠道微 生物群落多样性研究中，主要采用荧光原位杂交、末端 限制性片段长度多态性技术、变性梯度凝胶电泳以及生 物芯片等分子生物学方法，然而这些方法都存在一定的 缺陷。例如，变性梯度凝胶电泳只能检测到肠道中优势菌 ，对痕量微生物却束手无策，灵敏度较低； 荧光原位 杂交技术必须依赖寡核苷酸探针的特异性， 只能检出 已知菌而不能用于鉴定未知微生物； 生物芯片则通过 固定在芯片上的探针来获得微生物多样性的信息，“只 能验证已知，却无法探索未知”，并且在判断微生物的 丰度方面也存在缺陷。高通量测序技术以其数据量大， 成本低，速度快的特点，使肠道微生物宏基因组学
7、研究 产生了质的飞跃，它能够更加准确、深入地分析肠道微 生物生态系统的微生物结构组成、基因功能、代谢途径 以及膳食和营养对肠道微生物的影响作用。早期， 细菌的16S rRNA 被称为“分子钟”，这归 功于它的通用性、细胞活性、高度保守的核苷酸序列结 构以及长度适中易于快速测序的特点， 这些使16S rRNA 成为细菌分类学上的“金标准”。另外，根据进 化速率的不同，16S rRNA 中包含8 个高度保守的核苷 酸区域和9 个高度可变区。根据这些区域的比对差异可 以反映物种不同的进化关系， 一般两条16S rRNA基因 差异小于1%的认为是同一个种，小于5%的认为是同一 个属，小于10%的认为是
8、同一个科；此外，研究者还可 以根据序列差异（根据研究需要划分阈值一般为1%， 3%，5%） 将16S rRNA 聚类成分类操作（ Operational taxonomic unit，OTU）， 利用OTU 的数目、各个 OTU 的序列数来分析估计物种多样性和丰度。高通量测序技术在肠道微生物宏基因组学中的应用高通量测序技术在肠道微生物宏基因组学中的应用高通量测序技术在肠道微生物宏基因组学中的应用高通量测序技术在肠道微生物宏基因组学中的应用技术基于16SrRNA的肠道群落结构分析中的应用在基于16S rRNA 基因的肠道微生物群落结构分析 中， 由于高通量测序读长较短不能覆盖16S rRNA 的
9、全 长基因， 所以研究者对16S rRNA基因的一个或多个高 可变区进行测序， 而且有研究显示这些高可变区可以 高度精确地反映微生物群落中系统进化关系， 与16S rRNA 全长基因反映的进化关系基本一致。查阅文献，总结了国内外研究者在肠道微生物群落结构 分析中常用的测序区域，结果如表2 所示。高通量测序技术在肠道微生物宏基因组学中的应用高通量测序技术在肠道微生物宏基因组学中的应用高通量测序技术在肠道微生物宏基因组学中的应用高通量测序技术在肠道微生物宏基因组学中的应用由于在肠道微生物宏基因组学领域的诸多研究 表明， 只分析肠道微生物的群落结构信息远不能实现 对饮食结构和营养摄入是如何通过肠道微
10、生物影响机体 健康的深入探究， 因此通过高通量测序技术分析肠道 微生物宏基因组的功能基因显得非常必要。2010 年， 深圳华大基因研究院对124 个欧洲人的肠道菌群进行了 研究， 并对测序的序列进行了拼接、注释、功能基因 的分类以及多态性分析等研究。结果表明，这些基因中 有一部分基因存在于所有细菌中，主要参与碳循环、氨 基酸代谢以及核酸和ATP 的合成；还有一部分基因主要 与细菌在肠道内的功能有关， 如对宿主细胞和蛋白质 的附着作用、肠上皮细胞糖脂代谢等。这些基因中的大 部分具有我们未知的功能， 并且通过对菌群结构分析 表明人体肠道内包含约1150 种常见菌群，其中大部分 被人类肠道所共有，并
11、且在每个个体的肠道中至少有 160 种这类菌群。高通量测序技术在肠道微生物宏基因组学中的应用高通量测序技术在肠道微生物宏基因组学中的应用高通量测序技术在肠道微生物宏基因组学中的应用高通量测序技术在肠道微生物宏基因组学中的应用技术基于肠道微生物宏基因组的功能基因分析中的应用2012年，华大基因又研究了人体肠道微生物与II 型糖 尿病之间的关系，该研究通过Illumina 测序平台对345 个中 国人的肠道微生物样本进行了深度测序，并以全宏基因组相 关联研究（Metagenome wideassociation studies， MGWAS） 的方法对II 型糖尿病与肠道微生物失调之间的 关系进行
12、了深入研究，结果表明II 型糖尿病患者肠道菌群发 生失调，丁酸盐产生菌丰度下降，多种条件致病菌增多。另 外，上海交通大学赵立平教授实验室利用Illumina测序平台 对一个肥胖患者粪便菌群进行宏基因组测序分析， 通过构 建脂多糖（Lipopolysaccharides，PS）合成基因数据库 并将测序数据与该数据库比对而筛选出一株导致肥胖的阴沟 肠杆菌B29；进一步研究发现该菌株能使无菌小鼠在高脂饮 食条件下表现出明显的肥胖和胰岛素抵抗的表型，说明肠道 内毒素产生菌具有诱发无菌小鼠发生肥胖和胰岛素抵抗的作 用， 提示肠道内高水平的内毒素产生菌是导致该个体极端 肥胖发生的原因而不是结果。高通量测序
13、技术在肠道微生物宏基因组学中的应用高通量测序技术在肠道微生物宏基因组学中的应用高通量测序技术在肠道微生物宏基因组学中的应用高通量测序技术在肠道微生物宏基因组学中的应用技术基于肠道微生物宏基因组的功能基因分析中的应用科学合理的饮食结构和营养干预可以通过调 整肠道菌群结构达到改善机体健康状况的目的，而基于 高通量测序技术的肠道微生物宏基因组学为研究肠道微 生物与人体健康的关系提供了全新的思路和方法。我们 可以综合利用食品科学、肠道微生物宏基因组学以及其 它组学技术， 如代谢组学、转录组学等实现通过肠道 菌群结构来判断相关疾病的发生， 并通过合理的饮食 结构和营养干预来调控肠道微生态的平衡以实现改善宿 主健康的目的。以肠道微生物为靶点，利用高通量测序 技术和肠道微生物宏基因组学的方法， 通过饮食结构 的调整和生物制剂的摄入来干预和治疗相关疾病将成为 生命科学和食品科学研究领域的一个重要探索方向。展望展望展望展望谢谢！谢谢！谢谢！谢谢！
