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1、水溶性酵母葡聚糖的制备及应用研究进展摘 要:啤酒酵母葡聚糖是一类免疫多糖,参与生物细胞的多种生命调节,可激活免疫细胞, 调节机体免疫力,具抗菌消炎、抗病毒、抗肿瘤等功能,且毒副作用低,被称为生物效应应答 剂。近年来,越来越多的学者开始研究和开发酵母葡聚糖。论文对酵母葡聚糖的结构、提取 方法、结构修饰和应用进行了简述,对提取方法和结构修饰中的各种方法进行了综合比较和 分析;并重点介绍了提高酵母葡聚糖的水溶性的方法及相对应的鉴定方法,这将为酵母葡聚糖 的开发利用奠定一定的理论基础。除此之外,论文还对酵母葡聚糖的进一步开发利用进行了 展望。关键字:酵母葡聚糖;提取方法;分子修饰;鉴定啤酒酵母葡聚糖是
2、从啤酒酵母细胞壁中提取的 一种葡萄糖聚合物,因为它具有增强免疫功能的能 力,被誉为是生物效应应答剂1。研究表明,啤酒酵 母葡聚糖对哺乳动物的特异性和非特异性免疫功能 均有刺激作用2,可以促进巨噬细胞对多种病原,如 细菌、病毒、真菌和寄生虫等的免疫反应,进而提高 机体免疫系统对病原体侵入的抵抗力。但由于酵母 葡聚糖难溶于水和纯度低等原因,限制了它作为药 物在生产中的应用,因此开发和利用水溶性酵母葡 聚糖,具有广阔的应用前景和市场开发潜力。 1 酵母细胞壁的结构 啤酒酵母细胞壁占细胞干重的 20%30%,酵 母细胞壁由 29%64%的 B 葡聚糖、31%的甘露聚 糖、13%的蛋白质、9%的脂类和
3、1%2%几丁质组 成3。葡聚糖是酵母细细胞壁最重要的结构成分之 一,其主要包括碱溶性和碱不溶性两种,其中以碱不 溶性 B-1,3-葡聚糖占绝大多数。酵母碱不溶性 B1, 3-葡聚糖是一种活性多糖,制备酵母 B-葡聚糖即提 取碱不溶性 B-1,3-葡聚糖。目前,其结构研究得较 为清楚,大部分是由 D-葡萄糖通过 B-1,3-键的方式 相结合的聚合物,也有小部分以高度分支的 B-1,6- 键结合的葡聚糖4。B-1,3-葡聚糖生物活性主要由 连接方式、分子大小和构象所决定,高分子的 B-1,3- 葡聚糖具有独特的分子结构,它通常以三股螺旋的 构象存在,这种三股螺旋结构对其免疫调节活性起 至关重要的作
4、用。酵母细胞壁中碱不溶性多糖 80%以上是 B-1,3-D-葡聚糖,其分子质量大约为 240 ku,具有很强的免疫活性5。 2 酵母葡聚糖的提取 目前国内外提取酵母 B-1,3-D-葡聚糖的方法主 要有酸法、碱法和酸碱综合法等。 2.1 酸法提取酸法提取是最早采用的酵母 B-1,3-葡聚糖提取 方法。一般用不同浓度的醋酸在 50e90e 温度 条件下处理 3 h6 h,离心后沉淀脱水,干燥即得成 品。早期国内外学者对此法进行了较多的研究,黄 丹等6、黄刚良7对此提取方法进行了研究,结果表 明,此法虽然产品得率高,但纯度低,产品中蛋白质 和甘露聚糖含量高,需要进一步纯化。由于这些原 因使其应用受
5、到一定程度的限制,近年来国外对此 提取方法的报道很少。但若对成品 B-1,3-葡聚糖的 纯度要求不高,如作为饲料添加剂使用,其不失为一 种经济有效的提取方法8。 2.2 碱法提取 李卫旗等9用碱法提取酵母 B-1,3-葡聚糖。用 不同浓度的 NaOH 高温处理 3 h6 h,离心后沉淀 脱水,干燥即得成品。廖鲜艳等10对此法进行了改 进,采用二步碱处理方法进行提取,降低了碱处理时 NaOH 溶液浓度,并提高了产品的纯度。万婕等11 进一步改进提取工艺,在碱处理后离心,沉淀用蒸馏水悬浮,再用盐酸调节 pH 至 4.5,离心、 水洗、脱水、 干燥。由于采用了酸性溶液洗涤,除去了部分酸溶 性的糖元及
6、 B-1,6-D-葡聚糖,因而纯度又有所提高。 碱法提取所得的产品得率稍低,纯度较高,但产品中 还含有少量酸溶性糖元及 B-1,6-D-葡聚糖。此法较 适于对提取物纯度要求较高的产品,如食品和医药 用品。 2.3 酶-碱法 Freimund S 等12采用碱性 Savinase 蛋白酶来 处理酵母细胞壁制备酵母葡聚糖,得到含量 85%以 上的葡聚糖样品。马森等13利用木瓜蛋白酶-碱法, 得到了纯度为 90.50%,得率为 11%的酵母葡聚糖。 酶处理酵母细胞壁后能去除大量蛋白,从而降低后 续碱的浓度和使用量,使得到的酵母葡聚糖产品分 子结构更加完整。由于葡聚糖的分子结构与其生物 活性密切相关,
7、因此,酶法更适合于大规模酵母葡聚 糖的提取纯化。 2.4 其他方法 除上述传统的方法外,一些研究学者还采用其 他方法来制备纯度较高的酵母葡聚糖产品。日本 Ohno N 等14采用次氯酸钠溶液在室温条件下处理 酵母细胞壁得到的高纯度酵母葡聚糖产品,收率为 20%。此方法虽能得到纯度较高的酵母葡聚糖,但 是强氧化剂对葡聚糖分子结构的影响还有待深入研 究,需考察对其生理活性的影响。 以上方法获得的 B-1,3-葡聚糖呈中性,不带电荷,由于其分子内多羟基的相互作用,形成了致密的 三股螺旋结构,导致 B-1,3-葡聚糖不溶于水,只能作 为饲料添加剂通过口服途径来加以利用。当动物采 食含有酵母葡聚糖的饲料
8、后,其特异性和非特异性 免疫功能都得到了增强。但口服途径中会造成一定 的浪费,酵母葡聚糖中的有效成分也会在动物体内 被消化系统消化掉一部分。许第新等15将从酵母 细胞壁中获得酵母葡聚糖以腹腔注射方法,用于增 强克氏原螯虾的免疫功能,取得了良好的效果。但 该方法在安全性方面令人担忧。当腹腔内注射酵母 葡聚糖时,不溶或可溶性很差的 B-葡聚糖直接注射 进动物体内后,可能导致排斥反应,如发炎、疼痛、微 栓塞、形成肉芽肿等限制了它作为药物的应用。如 果能提高酵母葡聚糖的纯度和水溶性,通过注射等 手段应用于人和动物,来提高其免疫力,对实际应用 更有意义。因此,研究开发水溶性酵母葡聚糖,具有 很好的应用前
9、景和市场开发潜力。 3 酵母葡聚糖的结构修饰及鉴定方法 酵母葡聚糖的结构修饰是提高葡聚糖水溶性的 一种方法。目前提高葡聚糖水溶性的主要有方法 有:物理修饰法,生物修饰法和化学修饰法。 3.1 物理修饰法)超声波法 物理修饰法主要是在不破坏酵母细胞壁多糖基 本分子结构的基础上,应用外力方式将其主链打断, 使其变为可溶性的小分子,以增加其溶解性。目前 主要使用超声波解聚的方法对酵母葡聚糖进行修饰 改性16。张开诚17对酸碱法、酶-酸碱法、超声法进 行了对比提取试验,结果表明,超声波法提取葡聚糖 工艺简便,成本低廉,收率较高,提取后的废液不含 酸碱,对环境的污染较酸碱法要小,是一种非常有前 途的提取
10、葡聚糖的有效方法。 3.2 生物修饰法)酶法 酶法水解酵母葡聚糖是通过 B-1,3-葡聚糖内切 酶来降低其聚合度,从而得到水溶性葡聚糖。B-1,3- 葡聚糖内切酶能将 B-1,3-葡聚糖水解为低聚糖、寡 糖或还原糖。采用 B-1,3-葡聚糖酶法增溶,不仅可 通过控制水解度获得一定分子质量的水溶性的 B-1, 3-葡聚糖,而且可避免使用化学方法带来的污染及 安全等问题,因此日益受到重视。Kery V 等18研 究表明,酶法得率较低。段会轲等19利用木霉菌株 所产的 B-1,3-葡聚糖酶对酵母 B-1,3-葡聚糖进行酶 解增溶,得率达到 52%。尽管酶的专一性和活性会 对分子质量产生很大影响,其仍
11、具有较好的应用前 景。3.3 化学修饰法 酵母葡聚糖的化学修饰已大有进展,利用化学 方法对糖残基上的羟基、羧基、氨基等基团进行衍生 化,如硫酸化、羧甲基化、磷酸化和乙酰化等来提高 多糖的水溶性和活性。目前研究比较深入的有硫酸 化和羧甲基化。 3.3.1 硫酸化改性 酵母葡聚糖硫酸酯是酵母葡 聚糖糖大分子链中单糖分子上的羟基被硫酸根取代 而形成的一类天然、半合成酸性多糖。Williams D L 等20利用均相磺化反应体系制备水溶性葡聚糖。 由于是均相反应体系,产物和底物不好分离、产物杂 质高。黄国宏21将葡聚糖分散在二甲基甲酰胺中, 以氯磺酸为酯化剂制备出取代度高达 0.88 的酵母 葡聚糖硫
12、酸酯。这种方法的取代度较高,但氯磺酸 等为危险试剂,不易操作。Wang Y J 等22采用非 均相反应体系制备水溶性的 B-1,3-葡聚糖硫酸酯。 非均相反应体系很好地克服了均相体系的缺陷,提 高了产物纯度,产物分离容易,且硫酸正丙醇反应液 可重复使用,减轻了环境污染。 3.3.2 羧甲基化 目前常用的羧甲基化方法是将 129 王成龙等:水溶性酵母葡聚糖的制备及应用研究进展葡聚糖溶于 NaOH 溶液中碱化,再加 异丙醇、氯乙 酸,获得羧甲基化衍生物。Sandula J 等23采用氯乙 酸作为底物,与葡聚糖在丙醇中反应,得到了不同取 代度的羧甲基葡聚糖。杨文鸽等24以 ClCH2- COOH 为
13、羧甲基化试剂,获得了取代度为 0.925 的 水溶性葡聚糖。王庆华等25以异丙醇为分散剂、氯 乙酸钠为醚化剂,采用二次加碱醚化反应,制备了取 代度为 0.55 羧甲基葡聚糖。羧甲基葡聚糖的浓溶 液属假塑性流体,其流变性质受电解质、温度和 pH 的影响,升高温度或加入电解质均使其黏度下降,中 性 pH 的羧甲基葡聚糖的溶液的黏度最大26。 3.4 酵母葡聚糖衍生物的鉴定方法 酵母葡聚糖结构复杂,经修饰后更加复杂,仅用 传统的化学方法完全解析多糖结构是十分困难的, 在修饰多糖结构解析中常用紫外光谱、红外光谱、质 谱、核磁共振波谱等方法分析多糖取代基的取代情 况。 3.4.1 紫外光谱法 主要根据扫
14、描的紫外光谱在 206 nm 处有无吸收峰来判断是否含有酵母葡聚糖。 酵母葡聚糖硫酸酯的紫外扫描图在 218、264、268、 286nm 处有 S=O 和-SO3 的吸收,有别于一般的中 性多糖,可用来鉴定葡聚糖硫酸酯27。但是,仅靠 紫外光谱还不能完全确定,必须结合其他方法来联合验证。 3.4.2 红外光谱法 多糖结构解析中主要采用中红 外光谱。应用此法可以用来鉴定分子修饰的酵母葡 聚糖糖。硫酸酯化葡聚糖链上主要取代基的特征谱 为分子间、内氢键使糖羟基在 3 600 cm-1 3 200 cm-1 处出现一宽峰。根据红外光谱图是否具有 800 cm-1860 cm-1 处糖环 C-O-S
15、伸缩振动的特征 吸收峰以及 1240 cm-1 附近-O-SO3 的 S=O 伸缩振动 吸收峰,即可定性判断酵母葡聚糖残基是否连接上了 硫酸基团及硫酸基团的取代位置(800 cm-1 950 cm-1)。羧甲基葡聚糖如在波数 1 600 cm-1 处出 现较强的-COO-离子特征吸收峰, 1 423 cm-1 出现与 羧基相连的次甲基吸收峰,即表明其为羧甲基葡聚 糖24。 4 酵母葡聚糖的应用 4.1 酵母葡聚糖在水产动物方面的应用 酵母葡聚糖可加快鱼、虾等水产动物的免疫器 官发育,增加淋巴细胞数量,增强体液免疫,对水产 动物具有较好的防病、治病作用。Robertsen B 等28试验表明,酵
16、母菌聚糖能增强大西洋鲑对灭鲑 气单胞菌、鳗弧菌和鲁克耶尔森菌抗感染能力。研 究表明,酵母葡聚糖可提高鲫鱼血清总蛋白的含量, 并且其血清凝集抗体效价、溶菌酶的活性、白细胞的 吞噬指数均显著高于空白对照组29。 4.2 酵母葡聚糖在家禽方面的应用 酵母葡聚糖主要通过激发炎症反应和免疫应 答,维持动物胃肠道微生态平衡等来增强动物免疫 力,改善动物健康状况,增加其抗应激能力,从而提 高生产性能,增加经济效益。同时,它能顺利通过动 物胃肠道而不被消化的特点也保证了其作用的发 挥。李志清等30研究指出,肉仔鸡日粮中添加葡聚 糖能显著提高 0 日龄49 日龄鸡的日增量和饲料 转化率。刘影等31研究表明,纯化酵母葡聚糖作为 1 周龄的雏鸡的饲料添加剂,可显著对抗侵入雏鸡 内脏器官的肠炎沙门菌。 4.3 酵母葡聚糖在家畜方面的应用 由于酵母葡聚糖提取物难溶于水,所以主要作 为饲料添加剂在家畜饲料中应用。潘树德等32在 免疫接种猪瘟疫苗的断奶仔猪日
