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1、 1 / 15第第 2 课时课时 微生物的实验室培养微生物的实验室培养(二二)目标导读 1.通过阅读教材掌握配制培养基的步骤和倒平板操作的过程。2.理解并掌握利用平板划线法和稀释涂布平板法来纯化微生物的方法。重难点击 1.掌握制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的方法。2.学会用平板划线法和稀释涂布平板法纯化微生物。一 制备牛肉膏蛋白胨固体培养基牛肉膏蛋白胨固体培养基是细菌培养中常用的一种培养基，大肠杆菌的纯化是用该培养基。1.牛肉膏蛋白胨固体培养基的成分及各成分提供的营养培养基组分提供的主要营养物质牛肉膏 5.0 g碳源、磷酸盐和维生素蛋白胨 10.0 g氮源和维生素NaCl 5.0 g无机盐蒸馏水定
2、容至 1 000 mL氢元素、氧元素2.实验过程(1)培养基的配制计算：根据牛肉膏蛋白胨培养基配方的比例，计算配制 100 mL 培养基时各成分的用量称量Error!2 / 15溶化Error!调节 pH：1 moL 的 NaOH、pH 试纸，将 pH 调为 7.4 7.6分装：趁热分装到洁净锥形瓶中加棉塞：用棉花不用脱脂棉，脱脂棉吸水,包扎：外包牛皮纸，且挂标签(2)灭菌Error!(3)倒平板待培养基冷却至 50 左右时，在酒精灯火焰附近进行操作：在火焰旁右手拿锥形瓶，左手拔出棉塞(如图 1)。使锥形瓶的瓶口迅速通过火焰，目的是进行灭菌，防止瓶口微生物污染培养基(如图 2)。左手将培养皿打
3、开一条缝隙，右手将培养基倒入培养皿，立刻盖上皿盖(如图 3)。等待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置(如图 4)。3 / 153.培养基的选择：培养基配制好后，要放在恒温箱中保温 12 d，若无菌落生长则说明制备的培养基是合格的。4.平板倒置的原因：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。归纳提炼培养基的配制原则(1)目的要明确(根据微生物的种类、培养目的等)，如生产用培养基内可加入化学成分不明确的天然物质，而分类鉴定用培养基内必须加入已知化学成分的物质。(2)营养要协调，注意各种
4、营养物质的浓度和比例。营养物质浓度过低不能满足微生物的营养需求，过高对微生物的生长有抑制作用，另外，培养基中各营养物质浓度比直接影响微生物的生长繁殖和代谢产物的形成和积累，其中碳氮比(C/N)的影响较大。例如，在谷氨酸生产中，当培养基中的碳源与氮源的比为 41 时，菌体大量繁殖，而产生的谷氨酸少；当碳源与氮源的比为 31 时，菌体繁殖受到抑制，但谷氨酸合成量大增。(3)pH 要适宜，各种微生物适宜生长的 pH 范围不同，细菌 6.57.5、放线菌 7.58.5、真菌5.06.0。1.下列关于制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的叙述，错误的是( )A.操作顺序为计算、称量、溶化、倒平板、灭菌B.将称好的
5、牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯C.待培养基冷却至 50 左右时进行倒平板D.待平板冷却凝固约 510 min 后，将平板倒过来放置问题导析 操作顺序为计算、称量、溶化、调 pH、分装、灭菌、倒平板。解析 制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的步骤是计算、称量、溶化、灭菌、倒平板，不能颠倒。牛肉膏容易吸潮，所以当牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用玻棒取出称量纸。待培养基冷却至 50 ，4 / 15用手触摸锥形瓶刚刚不烫手，并且培养基处于溶化状态时，进行倒平板。平板冷却 510 min 后还需倒置。2.下列叙述错误的是( )A.右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞，为避免污染需放在酒精灯火焰附近B.倒平板整个过
6、程应在酒精灯火焰旁进行C.打开培养皿皿盖，右手将锥形瓶中的培养基倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖D.为避免水滴滴入培养基，平板应倒过来放置问题导析 (1)左手将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将培养基倒入培养皿，立刻盖上皿盖。(2)平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。二 纯化大肠杆菌纯化大肠杆菌就是为了获得大肠杆菌的纯种菌落，这需在培养时，尽量使菌落中的菌体来自于一个大肠杆菌的分裂，即这个菌落的细菌群体由一个大肠杆菌繁殖而来，这就需要接种时尽量接种单个的大肠杆菌，最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。1.平板划线法(1)原理：通过接
7、种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。(2)结合示意图，完成下面步骤：操作示意图操作将接种环放在酒精灯火焰上灼烧，在火焰旁冷却接种环，并打开盛将试管口通过酒将已冷却的接种环伸入菌液中，5 / 15直到接种环烧红有菌液的试管的棉塞精灯的火焰沾取一环菌液操作示意图操作将试管口通过酒精灯的火焰，并迅速塞上棉塞左手将培养皿皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基灼烧接种环，冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连将平
8、板倒置，放入培养箱中培养2.稀释涂布平板法(1)原理：将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。当稀释倍数足够高时，即可获得由单个细胞形成的菌落。(2)结合示意图，完成下面步骤：系列稀释操作a.将分别取盛有 9 mL 水的 6 支试管灭菌，并按 101106的顺序编号。b.用移液管吸取 1 mL 培养的菌液，注入 101倍稀释的试管中。用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸三次，使菌液与水充分混匀。6 / 15c.从 101倍稀释的试管中吸取 1 mL 稀释液，注入 102倍稀释的试管内吹吸均匀，获得 102倍液。依次类推，直到完成最后一只试管的稀释
9、。涂布平板操作操作示意图操作将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中取不超过 0.1 mL的菌液，滴加到培养基表面将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却 810 s用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使菌液分布均匀3.菌种的保存为了保持菌种的纯净，需对菌种进行保藏。保存时间保存方法具体方法后续处理频繁使用临时保藏法将菌种接种到试管的固体斜面培养基上，在合适的条件下培养，长成菌落后，放入 4 的冰箱中保藏每 36 个月需重新接种。否则菌种容易被污染或产生变异长期保存甘油管藏法在 3 mL 的甘油瓶中，装入1 mL 甘油后灭菌。将 1 mL菌液转移到甘油瓶中，与甘油充分混
10、合放入20 的冷冻箱中保存将菌种放在低温环境中保藏的目的是降低微生物的新陈代谢速率。归纳提炼1.平板划线法中几次灼烧接种环的目的7 / 15烧灼时期目的取菌种前杀死接种环上原有微生物每次划线前杀死上次划线后接种环上残留菌种，使下次划线的菌种直接来自于上次划线末端，使每次划线菌种数目减少，达到分离菌株的目的接种结束后杀死接种环上残存的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者2.稀释涂布平板法稀释涂布平板的操作比较复杂，且各个细节均需保证“无菌” ，应特别注意：(1)酒精灯与培养皿的距离要合适。(2)吸管头不要接触任何其他物体。(3)吸管要在酒精灯火焰周围使用。1.如图为纯化大肠杆菌的一个操作环节，下列
11、相关叙述中，错误的是( )A.该操作步骤是接种，方法是平板划线法B.除第一次划线外，以后的每一次划线的起点是上一次划线的末端C.图中细菌密度最小的是 5 处D.该接种方法适用于细菌的计数问题导析 (1)平板划线时，除了第一次划线外，其余每一次划线的起点是上一次划线的末端，随着划线次数的增加，线上的细菌密度逐渐变小，所以在图中细菌密度最小处是 5。8 / 15(2)由于平板划线法只在最后一次划线末端细菌呈单个存在，所以该方法不适合用于细菌的计数。解析 图中所示的纯化方法是平板划线法，该方法要求要连续划线多次，直到最后一次划线的末端细菌呈单个存在，所以该方法仅用于细菌的纯化，不适合用于细菌的计数。
12、1.有关稀释涂布平板法的叙述，错误的是( )A.首先将菌液进行一系列的梯度稀释B.然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面C.在适宜条件下培养D.结果都可在培养基表面形成单个菌落2.如图是微生物平板划线示意图，划线的顺序为 12345。下列操作方法正确的是( )A.只在操作前将接种环放在火焰边灼烧灭菌B.划线操作须在火焰上进行C.在 5 区域中才可以得到所需菌落9 / 15D.在 12345 区域中划线前后都要对接种环灭菌3.将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入 37 恒温箱的目的是( )A.对比观察培养基有没有被微生物利用 B.对比分析培养基上是否生有杂菌C.没必要放入未接
13、种的培养基 D.为了下次接种时再使用4.获得纯净培养物的关键是( )A.将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌B.接种纯种细菌C.适宜环境条件下培养 D.防止外来杂菌的入侵5.(1)在大肠杆菌培养过程中，除考虑营养条件外，还要考虑 、 和渗透压等条件。由于该细菌具有体积小、结构简单、变异类型容易选择、 、等优点，因此常作为遗传学研究的实验材料。(2)在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养器皿进行 (消毒、灭菌)；操作者的双手需要进行清洗和 ；静止空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白质变性，还能 。(3)若用稀释涂布平板法计数大肠杆菌活菌的个数，要
14、想使所得估计值更接近实际值，除应严格操作、多次重复外，还应保证待测样品稀释的 。(4)通常，对获得的纯菌种还可以依据菌落的形状、大小等菌落特征对细菌进行初步的 。(5)培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。对于固体培养基应采用的检测方法是 。(6)若用大肠杆菌进行实验，使用过的培养基及其培养物必须经过 处理后才能丢弃，以防止培养物的扩散。基础过关10 / 15知识点一 制备牛肉膏蛋白胨固体培养基1.以下关于制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的操作顺序正确的是( )A.计算称量倒平板溶化灭菌B.计算称量溶化倒平板灭菌C.计算称量溶化灭菌倒平板D.计算称量灭菌溶化倒平板2.制备牛肉膏蛋白胨固体
15、培养基的过程中，关于倒平板的具体描述正确的是( )等培养基冷却至 40 左右时，在酒精灯火焰附近倒平板将灭过菌的培养皿放在桌面上，左手拔出棉塞右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰用左手的拇指和食指打开皿盖右手将锥形瓶中培养基倒入培养皿，左手立即盖上皿盖等待平板冷却 510 s，将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上A. B. C. D.解析 培养基冷却至 50 左右时，在酒精灯火焰附近倒平板；将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿盛有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞；用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，而不是打开皿盖；等待平板冷却 510 min 后，将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上。改正后的步骤为倒平板的具体操作。3.在培养基的配制过程中，具有如下步骤，其正确顺序为( )溶化 调 pH 加棉塞 包扎 分装 称量A. B.C. D.解析 上述步骤中，培养基的配制顺序为称量溶化调 pH分装加棉塞包扎。11 / 15知识点二 纯化大肠杆菌4.用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数，原因是( )A.平板上的一个菌落就是一个细菌B.菌
