《两性霉素B及其卵磷脂-胆固醇脂质体降解动力学研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《两性霉素B及其卵磷脂-胆固醇脂质体降解动力学研究（13页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1两性霉素 B 及其卵磷脂- 胆固醇脂质体降解动力学研究作者：肖萍 杨丽 游劲松 史彩虹 曾群【摘要 】 目的 考察以卵磷脂、胆固醇为膜材制备的两性霉素 B脂质体的稳定性及降解动力学。方法 应用高效液相色谱法考察光和热对两性霉素 B 溶液及其脂质体中药物稳定性及降解动力学的影响，并拟合其降解动力学模型，求算降解半衰期。结果 两性霉素 B 溶液及其脂质体光降解分别符合一级和零级动力学过程，降解半衰期分别为 2.6 和 24.7d；热降解过程分别符合零级动力学和 Higuchi 方程；40下半衰期分别为 27.8 和 1532.8d；60 下半衰期分别为8.2 和 17.9d。结论 脂质体可明显降
2、低两性霉素 B 的光和热降解，延长药物降解半衰期，显著提高两性霉素 B 的稳定性。 【关键词】 两性霉素 B； 卵磷脂； 胆固醇； 脂质体； 稳定性；降解动力学ABSTRACT Objective To study the stability and degradation kinetics of amphotericin B in liposome. Methods The light and thermal stabilities of amphotericin B in liposome and solution were determined by detecting its 2con
3、tent using HPLC and the degradation kinetics was also investigated. Results The light degradation kinetics of amphotericin B in liposome and solution fit the zero- and first-order equations, and their half lives were 24.7d and 2.7d, respectively. While their thermal degradation kinetics complied wit
4、h the Higuchi model and zero-order equations, respectively. The amphotericin B in liposome was more stable than that in solution at 40 and 60. The half lives of amphotericin B in liposome and solution were 1,532.8d and 27.8d at 40, but 17.9d and 8.2d at 60, respectively. Conclusion The liposome can
5、improve the light and thermal stabilities of amphotericin B significantly.KEY WORDS Amphotericin B; Egg phospholipid; Cholesterol; Liposome; Stability; Kineticsequation近年来，深部真菌感染的发病率有升高趋势，且病情大多严重，病死率高，特别在严重全身性疾病(如恶性肿瘤、血液病)基础上免疫功能明显下降以及长期应用广谱抗生素、免疫抑制剂、肾上腺皮质激素或放疗、化疗时更容易发生。随着器官移植、骨髓移植等新技术的发展以及 AIDS 病患者
6、的增多，深部真菌感染率及病死率上升更明显。目前，两性霉素 B(amphotericin B，AMB)是治疗深部3真菌病疗效最确切的药物1 ，它对念珠菌、隐球菌、毛霉、曲霉、组织胞浆菌、球孢子菌等大多数深部真菌都具有强大的抗菌作用2 ，但由于其严重的毒副作用，特别是肾毒性，使其临床应用受到限制。临床研究表明将其制成脂质体后可大大降低其毒副作用36 。由于 AMB 本身稳定性较差，对光、热均不稳定，本文考察了天然磷脂制备的脂质体对 AMB 稳定性及降解动力学的影响。1 仪器与试药Jasco 高效液相色谱仪(日本分光公司) ，PU-1580 液相色谱泵( 日本分光公司)，UV-1575 紫外检测器(
7、日本分光公司)，Climacel 222型人工气候箱(德国 MMM 公司)，LS230 激光粒度分析仪(Beckman Coulter Co.)。AMB(华北制药集团新药研究开发中心 )，AMB 对照品(中国药品生物制品检定所)，二甲基亚砜(DMSO ，天津科密欧化学试剂开发中心)，乙腈 (天津康科德科技有限公司 )，Na2 EDTA(沈阳化学试剂厂)，卵磷脂( 上海东尚实业有限公司 )，胆固醇(上海化学试剂站分药厂)。2 方法和结果42.1 两性霉素 B 脂质体的制备及性质考察(1)两性霉素 B 脂质体(AMB-L) 制备7 分别定量称取卵磷脂、胆固醇于圆底烧瓶中用氯仿溶解，定量称取 AMB
8、 用甲醇溶解，将两者混合后于 55恒温水浴中旋转减压蒸发去除有机溶剂，形成均匀类脂薄膜，以氮气吹干残余溶剂，放入真空干燥箱内，真空干燥过夜。加入 3%的甘露醇水溶液 10ml 至烧瓶中， 50旋转洗膜1h，使脂质膜充分溶胀水化，得到脂质体混悬液。将混悬液用探针式间歇超声，用 0.45、0.22m 微孔滤膜依次过滤，4冷藏保存。应用激光粒度分析仪测定所制备 AMB-L 的粒度，透射电镜观察其形态，参考文献报道的方法8测定其包封率。测定结果表明所制备 AMB-L 的平均粒径为(13720)nm，90%的粒子小于 164nm，粒子的粒径范围为 77214nm。透射电镜观察其形态为单室脂质体。包封率测
9、定为 94%。(2)两性霉素 B 脂质体溶血性质的考察9 取家兔血，放入盛有玻璃珠的锥形瓶中振摇，除去纤维蛋白原，1500r/min 离心15min，收集沉下的红血球，用生理盐水洗涤 23 次，至上清液不显红色为止，将所得红细胞用生理氯化钠溶液配成 2%的混悬液，即得。5取具塞刻度试管，按 Tab.1 方法依次加入各种溶液，其中 7 号管为生理盐水空白对照，8 号管为阳性对照 (蒸馏水) 。各管轻摇混匀后，于 37水浴中放置 3h，每隔 30min 观察各管溶血程度，结果见 Tab.1。溶血程度按如下标准：无溶血(-)，红细胞全部下沉，上层液体无色透明；部分溶血()，溶液澄明，红色或棕红色，管
10、底尚有少量红细胞残留；全溶血(+)，溶液澄明，红色，管底无红细胞残留；凝集，虽不溶血，但出现红细胞聚集，振摇后不能分散。2.2 AMB 含量测定方法选择 HPLC 法检测 AMB 和 AMB-L 稳定性试验样品中的药物含量。色谱条件10，11 色谱柱：HiQ sil C18 柱(150mm4.6mm，5m) ；流动相：乙腈0.02mol/LNa2EDTA (4555，V/V)；流速 1.0ml/min；柱温为室温；检测波长407nm；进样量 10l。含量测定 精密量取待测样品 1ml，加入少量 DMSO，用乙腈2.5mmol/L Na2EDTA(6040，V/V)溶液稀释适宜倍数，制成药物浓度
11、约为 5g/ml 的溶液，摇匀，精密量取 10l，注入液相色谱仪，记录色谱图，另取 AMB 对照品同法配制溶液和测定，按外标法以6峰面积计算含量。含量测定色谱图见 Fig.1，AMB 的保留时间是6.917min；其余为溶剂峰。经方法学研究表明该方法专属强、准确、精密，可作为 AMB 稳定性研究的分析方法。2.3 数据处理稳定性试验中测定的药物含量分别按 Tab.2 所列方程进行拟合处理12 ，选取拟合度最大的模型计算药物降解半衰期。2.4 稳定性试验(1)稳定性试验样品 取 AMB 原料药，用 DMSOFig.1 HPLC Chromatograms of sample甲醇(11)溶解13，
12、14 ，制成浓度约 4.0mg/ml 溶液，分装于 2ml 的安瓿中，每瓶分装 1ml。AMB-L 分装于 2ml 的安瓿中，每瓶 1ml。(2)光照试验取 AMB 溶液和 AMB-L 样品，放于人工气候箱中光照(5000500)Lx，分别于 0、1 、5 和 10d 取样，照 2.2 项下方法测定药物含量，结果见 Tab.3 和 Fig.2。7按 Fig.1 中动力学方程拟合，结果表明在光照条件下，AMB 溶液和 AMB-L 的光降解分别符合一级和零级动力学过程，降解动力学方程分别为：lgC=-0.118t+0.547(r=0.96)C=-2.053t+101.4(r=0.96)降解速率常数
13、分别为 0.118 和 2.053%/d，半衰期分别为 2.6 和24.7d。(3)加速试验 取 AMB 溶液和 AMB-L 样品，放于 40和 60 恒温箱中， 分别于 0、 1、5 和 10d 取样(AMB 溶液增加 d8)，照 2.2项下方法测定药物含量，结果见 Tab.4 和 5，Fig.3 和 4。结果表明，AMB 溶液在 40和 60条件下降解过程均符合零级动力学过程，降解动力学方程分别为：C=-1.791t+99.84(r=0.965)C=-5.882t+96.19(r=0.992)8降解数率常数 k 分别为 1.791 和 5.882%/d，半衰期分别为27.8 和 8.2d。
14、AMB-L 在 40和 60条件下，降解过程均符合Higuchi 降解动力学过程12 ，降解动力学方程分别为：C=-1.306t1/2+99.46(r=0.945)C=-11.504t1/2+97.53(r=0.984)降解速率常数 k 分别为 1.306 和 11.504%/d1/2，半衰期分别为 1532.8 和 17.9d。3 讨论(1)AMB-L 是目前已上市脂质体制剂中的一种，国外已上市的AMB-L(商品名： AMBisome)是以氢化大豆卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰甘油和胆固醇为主要脂质体膜材，产品价格相对较高1 。本文主要以价格较低的天然磷脂、胆固醇为膜材制备 AMB-L 制剂，考察了
15、与其溶液相比的光、热稳定性和降解动力学的变化，从动力学角度证明了天然磷脂制备的脂质体使 AMB 稳定性的提高。该研究未见文献报道。(2)通过对 AMB-L 性质的考察，可知所制备的 AMB-L 的粒度较9小，且包封率较高。体外溶血试验表明，在 3h 内，AMB-L 在药物浓度 35224g/ml 时均无溶血现象，而 AMB 溶液在浓度为10g/ml 即出现溶血。以上数据表明本文所制备的天然磷脂 AMB-L 能有效降低药物的溶血，分析其原因可能是：AMB 的抗菌机制是与真菌细胞膜上的麦角甾醇结合导致细胞表面形成许多小孔，膜渗透性增加，细胞内成分外漏而致细胞死亡。AMB 也可与红细胞表面的胆固醇结
16、合，导致红细胞破裂；而 AMB-L 将药物包封于脂质体中，有效降低了药物与红细胞表面的胆固醇结合，大大降低了AMB-L 的溶血性，也说明了本文制备 AMB-L 稳定性良好，药物不易渗漏。(3)由数据可知， AMB 溶液和 AMB-L 的光降解分别符合一级和零级动力学过程，AMB 溶液在光照条件下降解非常严重，10d 降解94.5%；而 AMB-L 可有效减慢药物的光降解。分析其原因可能是药物被脂质体包裹后，减弱了光直接照射的强度，从而降低了药物的降解速度。(4)AMB 溶液在 40和 60的降解均符合零级动力学过程，而AMB-L 在 40和 60的降解均符合 Higuchi model 过程，说明AMB 制成脂质体脂质体后，改变了药物的热降解动力学过程。两种剂型都是随温度升高，药物降解加快，但与溶液剂相比，脂质体显著提高 AMB 的热稳定性，40加热 10d AMB-L
