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1、1不同提取方法对虎杖中蒽醌类成分及其抗氧化活性影响的研究作者：刘建华，韩立强，赵汉雨，莫娟，张素梅，潘玉善【摘要 】 目的研究不同提取方法对虎杖蒽醌类成分及其抗氧化作用的影响。方法采用回流、索氏、微波及超声四种提取方法，测定四种提取液中的游离蒽醌和总蒽醌的含量；采用 DPPH，FRAP 两种方法测定其抗氧化活性，并分析蒽醌类成分和抗氧化活性之间的关系。结果在对游离蒽醌的测定中以索氏法为最高（0.53% ） ，其次为超声（0.45%） ，各种方法之间相比差异显著（ P0.05） ；在对总蒽醌的测定中，结果如下：索氏（1.16%）超声（ 1.15%）微波（1.04%）回流（0.80%） ；抗氧化活
2、性测定发现，以回流液的抗氧化能力最强，其次是微波，二者与超声和索氏的相比有显著性差异（P0.05） ；相关性分析发现，蒽醌的含量与抗氧化活性呈显著的负相关(P0.01) 。结论不同提取方法影响虎杖蒽醌类成分和抗氧化活性，蒽醌类成分和抗氧化活性之间具有负相关的关系。 【关键词】 提取方法； 虎杖； 蒽醌； 分光光度法； 抗氧化Abstract:ObjectiveTo explore the effect of different 2extraction methods on the content of anthroquinone compound and its antioxidative a
3、ctivity in Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.MethodsAnthroquinone compound was extracted respectively by reflux method, Soxhlet extraction method ultrasound wave method and microwave-assisted extraction. The free and total anthroquinone content and its antioxidative activity was determined by spect
4、rophotometry. The correlation between anthroquinone compound and antioxidative activity was analyzed.ResultsThere were significant differences in the extraction content of free anthroquinone content among the four extraction method stated（P0.05 ）,Soxhlet extraction method was the highest（0.53%） ，ult
5、rasound wave method was better（0.45%）. In the determination of total anthroquinone, the result was:Soxhlet extraction method（1.16%） ultrasound wave method（1.15%）microwave-assistedreflux method extraction. The reflux method was better than microwave-assisted extraction, compared with Soxhlet extracti
6、on method and ultrasound wave method. There were significant differences in the determination of its antioxidant activity（P0.05） There was significant negative correlation between anthroquinone 3compound and its antioxidative activity (P0.01) .ConclusionAnthroquinone compound and antioxidative activ
7、ity in Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc. was affected by different extracting methods, there was negative correlation between anthroquinone compound and antioxidative activity.Key words:Extraction method; Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.; Athroquinone compound; Spectrophotometry; Antioxidative
8、activity虎杖系蓼科蓼属植物虎杖 Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.的根茎和根，具有抗菌、抗病毒等广泛的治疗作用1 。其主要有效成分为蒽醌类、二苯乙烯类、黄酮类等。随着近年来对其药理作用的深入研究，虎杖的抗氧化作用也日益为人们所重视2，3 。蒽醌类成分作为虎杖中主要有效成分，在治疗疾病过程中起着较为重要的作用，本实验主要研究了不同提取方法对虎杖中蒽醌类成分及其抗氧化作用的影响，并分析蒽醌类成分和抗氧化活性之间的关系。1 仪器与材料41.1 仪器JY92-超声波细胞破碎仪，宁波新芝科器所；微波炉，广东美的微波炉制造有限公司；UV-2800 紫外分光光度计，
9、尤尼柯（上海）仪器厂；酸度计，意大利哈钠；微量移液器，eppendorf；Sartorius 电子天平（型号 1702，称量范围 200g，感量 0.1mg）,德国 Sartorius；FZ102 微型植物试样粉碎机，北京市永光明医疗仪器厂；回流提取装置；索氏提取装置。1.2 材料大黄素对照品（中国药品生物制品检定所，批号110756200110，供含量测定用，经归一化法标定 98.0%） ；二苯代苦味酰基自由基(1，1-pheny-2-picrylhydrazyl，DPPH) Sigma；TPTZ（2，4，6-tripyridyl-s-trizine）Sigma ；虎杖药材（购自河南仟僖堂医
10、药公司，经河南中医学院曹继华教授鉴定为正品） ；其余试剂均为国产分析纯。2 方法2.1 对照品溶液的制备精密称取大黄素对照品 (105干燥至恒重)4.1 mg，置 50 ml 量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度。精密5吸取上述溶液 1 ml，置 10 ml 量瓶中，加 0.5%醋酸镁- 甲醇溶液至刻度，作为对照品溶液。2.2 样品的前处理将虎杖经过干燥，采用微型植物试样粉碎机进行粉碎，过 60 目筛，粉末经恒温（60)干燥 24 h 后，放干燥器中，备用。2.3 供试品溶液的制备2.3.1 回流提取液的制备精密称取 2.2 项下样品约 0.5 g，置50 ml 的圆底烧瓶中，加 70%的乙醇回流提
11、取 3 次，提取时间分别为 1.5，1，1 h，乙醇用量分别为 20，15 ，15 ml，合并 3 次回流提取液，定容至 100 ml 的容量瓶中，备用。2.3.2 索氏提取液的制备精密称取 2.2 项下样品约 0.5 g，采用 70%乙醇进行索氏提取，提取至无颜色为止（约 6 h） ，提取液定容至 100 ml 的容量瓶中，备用。2.3.3 超声提取液的制备精密称取 2.2 项下样品约 0.5 g，置50 ml 的三角瓶中，70%的乙醇超声提取 3 次，3 min/次（辐射时间为 10 s/次，间隙 10 s，工作 18 次） ，乙醇用量分别为 20，15 ，15 ml。合并 3 次的超声提
12、取液，定容置 100 ml 的容量瓶中，备6用。2.3.4 微波提取液的制备精密称取 2.2 项下样品约 0.5 g，置50 ml 的三角瓶中，70%的乙醇微波提取，提取 3 次，1 min/次，（工作时间为 10 s/次，间隙 60 s，工作 6 次） ，乙醇用量分别为20，15，15 ml。合并 3 次的微波提取液，定容置 100 ml 的容量瓶中备用。2.4 蒽醌百分含量的测定2.4.1 游离蒽醌百分含量的测定分别精密吸取 2.3 项下各供试品溶液 10 ml，水浴上蒸干，再加 20 ml 蒸馏水溶解，加氯仿萃取 3 次（20，15 ，15 ml） ，合并 3 次氯仿萃取液，定容至 50
13、 ml的容量瓶中，精密吸取 15 ml，水浴上蒸去氯仿，残渣用 0.5%醋酸镁-甲醇溶液溶解，定容至 10 ml 的容量瓶中，摇匀，放置 20 min。以 0.5% 醋酸镁- 甲醇溶液为空白，测定其在 510 nm 处吸光度值。2.4.2 总蒽醌百分含量的测定分别精密吸取 2.3 项下各供试品溶液 10 ml，水浴上蒸干，加 2.5 mol/L 的硫酸 20 ml 水解 2 h，稍冷，加氯仿 20 ml 继续水解 2h。放置至室温后，转移至分液漏斗内，并用氯仿洗涤烧瓶，并入分液漏斗中，分取氯仿层置 100 7ml 的容量瓶中，酸水层继续用氯仿萃取 3 次（20，15 ，15 ml） ，并入上述
14、 100 ml 的容量瓶中，精密吸取 30 ml，蒸馏水洗至中性，置水浴上挥干氯仿层，残渣用 0.5%醋酸镁-甲醇溶液溶解，定容至10 ml 的容量瓶中，摇匀，放置 20 min。以 0.5%醋酸镁-甲醇溶液为空白，测定其在 510 nm 处吸光度值。2.5 抗氧化活性的测定2.5.1 总抗氧化能力的测定5 取 2.3 项下各供试品溶液，适当稀释后移液器取 100 l，加入 FRAP 工作液（300m mol/L 醋酸盐缓冲液，10 m mol/LTPTZ，20m mol/LFeCL3）3ml，混匀反应 20 min，于 593 nm 处读取吸收度，以 FeSO4 为标准物质绘制标准曲线，样品
15、的抗氧化能力以 FRAP 值表示： 1FRAP 单位=1 mmol/L FeSO4，即样品的抗氧化能力相当于 FeSO4 的 mmol/L数。2.5.2 清除自由基能力的测定6取 2.3 项下各供试品溶液，适当稀释后移液器取 100 l，加入 2 ml 0.2 m mol/L DPPH 的乙醇溶液，混合均匀，黑暗下室温避光反应 20 min，在 517 nm 处测定吸光度，同时以 2 ml DPPH+100 l 缓冲溶液混合后的吸光度为空白组，计算清除率/%=1 药品组 A517/空白组 A517100%。82.6 系统适用性实验2.6.1 测定波长的选择取大黄素对照品适量，用 0.5%醋酸镁
16、-甲醇溶液溶解，在 360600 nm 波长间进行扫描，发现大黄素在510 nm 处有最大吸收峰，故选 510 nm 作为检测波长。见图 1。2.6.2 线性关系考察精密称取大黄素对照品 (105干燥至恒重)4.1 mg，置 50 ml 量瓶中，甲醇溶解，定容至刻度。精密吸取0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 ，1.6 ，2.0 ml，分别置于 10 ml 量瓶中，加 0.5% 醋酸镁 -甲醇溶液至刻度，放置 20 min。以 0.5%醋酸镁-甲醇溶液为空白，分别测定溶液在 510 nm 处的吸光度。以吸光度对浓度进行线性回归，得到回归方程： Y=0.044 3X+0.013 7，线性范围为 3.2816.4 g/ml，r=0.999。2.6.3 精密度实验取 2.1 项对照品溶液，重复测定 5 次，测得的吸光值 RSD 为 1.3%（n=5） 。2.6.4 重现性实验取虎杖 5 份，按 2.3.3 项下的供试品溶液的制备方法
