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1、原创性声明本人声明:所呈交的硕士学位论文，是本人在指导教师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内 容 外， 本论文 不 二包含 任何 其 他个人 和集体已 经发 表或 撰写 过的作品成果。对木文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。从/ 矛日加|/、学位论文作者签名:日 期 : ， 洲 产乡 年6 月关于论文使用授权的说明本人同意学校有权保留并向国家有关部门送交学位论文的复印件，允许论文被查阅和借阅。同意 ( 或小同意)学校及国家有关机构可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。
2、论文作者签名指导教师签名: 4 、7,J 日期:7 ,OV 3 13 K4日 期 ， vv 6 A * . a吉林大学硕士学位论文提要应用免疫组化技术及酶联免疫技术， 观察了6 9 例手术切除的卵巢子宫内膜肿瘤中环氧合酶一 2 的表达及血清C A - 1 2 5 的测定值变化。 本研究目的探讨 C O X - 2蛋白表达与卵巢子宫内膜肿瘤发生、发展的关系及其临床意义，C O X - 2 蛋白 表达与血清C A - 1 2 5的关系。结果表明C O X - 2 在卵巢子宫内膜肿瘤中的肿瘤细胞中有表达，与血清C A - 1 2 5 呈平行关系。 在卵巢子宫内 膜肿瘤细胞中，C O X - 2的表达
3、与肿瘤组织学分级、淋巴结转移呈显著相关性( P O . 0 5 ) 。 本研究证实了C O X - 2 是肿瘤发生的早发基因， 提示对C O X - 2 与卵巢肿瘤之间关系的深入研究， 将对揭示卵巢肿瘤的发生、发展规律有着重要意义。关键词: 卵巢子宫内 膜样癌C O X - 2 免疫组化吉林大学硕士学位论文前言环氧合酶 ( C Y C L E O X Y G E N A S E , C O X ) 又名前列 腺素内 过氧化物合成酶，是一种膜结合蛋白， 具有环氧合酶和过氧化物合成酶双重酶的功能， 是前列腺 素 合成过 程中 的 一 个重 要限 速 酶t o 。 前列 腺 素 ( P G s )
4、的 生 物 合成 有三步:( 1 ) 磷脂酶A 2 ( P L A 2 ) 水解膜磷脂， 产生 花生四 烯酸。 ( 2 ) 前列腺素内 过氧化物合成酶 ( P ( ;H S , ) ，也称环氧合酶 ( C O X ) ，将花生四烯酸氧化成P G / H z ( P G H 2 ) oC o x 催化两个反应环氧合酶反应， 将花生四烯酸转化为P G G . 过氧化物酶反应，P G G : 获得两个电子而被还原成P G H 2 . ( 3 ) P G H 2 被单个的合成酶或还原酶作用转化成具有生物活性的终末产物， 如P G D 2 , P G E 2 . P G F , , P G 1 2 ,
5、T X A 2 等，新合成的P G s 可通过载体介导的弥散离开母细胞， 然后通过G 蛋白偶联的受体， 作用于局部母细胞或邻近细胞。1 9 7 6 年M i y a m o t o 等从牛的 精囊腺提纯了P G H S - 1 称环氧合酶- 1 ( C O X - 1 ) : 1 9 8 9 年 S i m m o n s 鉴定了第二个，诱导型的C o x ，称为P G H S - 2 或C O x - 2 ，为c o x - 1 的同工酶 .- 。 c o x - 1 和C O X - 2 ， 虽然结构相似， 但因 其生物学特异性上的差异， 在正常和病理组织中发挥着不同的作用。C O X -
6、 1 和C O X - 2 基因在人体组织中均存在，正常情况下，C O X - 1 基因是结构性表达基因 ， 参与“ 看家” 活动。 C O X - 2 是诱导性表达基因， 在静止细胞中 不易 被检测到， 诱导 作用是分两种情况下进行， 生理情况下的 诱导产生C O X - 2 0 6 A 和蛋白 质的量少， C O X - 2 m R N A 可以 检测， 而C O X - 2 蛋白 质却测不出.但它对维持人体正常生理功能起重要作用; 而病理条件下产生的C O X - 2 m R N A 和蛋白 质是可以检测的， 如在炎症、 肿瘤形成时等等。 实验证明，正常情况下， 绝大部分组织细胞中C O
7、 X - 2 基因不表达，只有在细胞内外广泛吉林大学硕士学位论文的刺激物作用下，才诱导性表达5 . 6. 7 日 。不同刺激作用各类细胞，诱导C O X - 2 m R N A 的表达过程是相似的。 一般情况下，当刺激作用于细胞，3 0 分钟后可以 测到C O X - 2 m R N A . 1 - 2 小时达到高峰， 4 - 6 小时开始下降， 诱导而产生的 C O X - 2的量随细胞类型不同而改变，随着 C O X - 2 m R N A的产生，有大量的C O X - 2蛋白质及其代谢产物合成.用定量反转录 P C R ( R T - P C R )方法对组织C O X - 1 和 C
8、O X - 2 m R N A进行分析发现:前列腺含量最高，且 C O X - 1 和 C O X - 2的含员基本相等;肺C O X - 2 呈高表达，C O X - 1 m R N A 较C O X - 2 m R N A 低两倍，乳腺、胃、 小肠、子 宫的C O X - 1 和C O X - 2 显示中等水平表达， 翠丸、 胰腺、 肾、胸腺、 脑C O X - 1 和C O X - 2 m R N A 的 水平最低“ , C O X - 2 是 “ 早期即时” 性基因10 1 ，它可被迅速诱导，严格的 调控。 在 基础条 件下， C O X - 2 表达是高 度受限的，而在炎症过程中却能
9、奇迹般地升高。 C O X - 2 被破坏后出现以下的表现:( 1 )卵巢发育过程中黄体缺乏;( 2 )肾病;( 3 ) 心脏纤维化:( 4 )容易感染腹腔炎症训。长期服用非田体抗炎药 ( N S A I D s )可降低家族性多发性肠腺瘤的发生频率 和肿瘤大小 17 1 。 通过 近年来对C O X - 2 的 研究及 选择性C O X - 2 抑制剂的 应用， 在一定程度上抑制了肿瘤的发生和发展， 说明C O X - 2 对肿瘤的生成有重要的作用。 C O X - 2 水平的增加有可能作为 肠道肿瘤发生的早期标志，同时也可能是一个治疗靶位。但其作用机制还不十分清楚，可能为 ( 0 抑制细胞
10、凋亡;( 2 ) 调节炎症/ 免疫抑制功能;( 3 )促进血管生成;( 4 )增加肿瘤细胞的 侵 袭能 力; ( 5 ) 促 进癌 前 病 变向 肿 瘤 转化 而 参与 癌的 形 成。 T s u J 1 1 (131等入提出C O X - 2 可能通过一个旁分泌机制促进肿瘤发生。许多 实验 u . 7z 1 提示C O X - 2 过表达在增加肿瘤发生的同时，也增加其转移的潜能。吉林大学硕士学位论文C O X - 2 表达与肿瘤分化有关，高分化的腺癌中C O X - 2 m R N A 水平升高，在肺、胃 结肠腺癌、 肝癌组织中均有相似的发现【 16 . IL l8 . 19 . 1 ，免疫
11、组化检测发现C O X - 2 的表达随癌组织分化程度降低而降低，直到不能检测。随着 C O X - 2在恶性肿瘤中研究的深入，其在妇科肿瘤中的研究也逐渐起步， 但目 前有关C O X - 2 与 妇 科恶性肿瘤关系的 报道尚少(2 0 . 2 1 2 2 .2 2 . 2 6 2 5 1在卵巢子宫内膜样癌中的表达尚未见报道。 本研究应用免疫组化技术及酶联免疫分析技术， 观察了 在卵巢子宫内 膜样癌中环氧合酶- 2 的表达及血清糖链抗原C A - 1 2 5 的测定值变化。从而 探讨C O X - 2 蛋白表达与卵巢子宫内膜肿瘤发生、发展的关系及其临床意义， C O X - 2 蛋白 表达与血
12、清C A - 1 2 5 的关系。 为卵巢子宫内膜样癌的诊断及治疗提供一个新的研究方向.吉 林大学硕士学位论文材 料 与 方 法1 组织标本组织标本选自吉林大学第二医院1 9 9 9 年1 月至2 0 0 2 年6 月收治的患者经手术切除的标本 6 9例，均经病理检查确诊:其中卵巢子宫内膜样癌4 1 例，交界性卵巢肿瘤1 0 例，卵巢子宫内膜样囊肿9 例，正常卵巢9 例( 子宫脱垂或子宫肌瘤患者同时切除卵巢组织，经H E 染色确定) ，年龄为2 7 - 7 6岁，平均为5 2岁。根据细胞形态和分化程度分为6 1 , G 2 . G 3 级;G 1 级为高分化1 5 例; G 2 级为中分化 1
13、 3 例; G 3 级为低分化 1 3 例。肿瘤临床分期采用国际妇产科协会 ( F I G O , 1 9 8 5 ) 修订的临床分期标滩， 4 1 例卯巢子宫内膜样癌的临床分期为I 一 W期:其中有 1 8 例的病理检查证实有不同程度的盆腔淋E . 结转移:因病例大部分为2 0 0 1 - 2 0 0 2 年，故其生存率有待进一步研究。已知C O X - 2 阳性结肠癌2 例。2 .主要试剂羊抗人C O X - 2 多克隆抗体购自 上海康成生物有限公司， 为S a n t a C r u zb i o t e c h n o l o g y 产品， 浓缩型。 即用型S A B C 免疫组化染
14、色试剂盒购于武汉博士德生物有限公司。3 免疫组织化学染色3 . 1 染色方法及步骤:所有新鲜组织标本， 均经甲醛固定， 石蜡包埋切片厚S u m ， 行H E 染色及免疫组化染色。免疫组化采用A B C 法。具体方法械加 热9 8 5:( 功石蜡切片常规脱蜡至水洗。 c 2 ) 修复; 以拘橡酸盐修复分钟，室温冷却 3 0分钟， 水洗.( 3 ) 3 % H 1 0 : 阻断:3 7 0C温箱吉林大学硕士学位论文2 0 分钟，水洗，P B S 洗。( 4 )滴加正常山羊血清封闭液3 7 0 C, 2 0 分钟。( 5 )不经水洗，倾去多余液体，滴加一抗 ( C O X - 2 ) ，稀释度 1
15、 : 8 0 , 3 7 0C 1小时3 0 分钟。( 6 ) P B S 洗5 分钟3 次。( 7 ) 滴加二抗， 兔抗山羊I g ( ; 即用型3 7 0C,2 0 分钟。( 8 ) P B S 洗5 分钟3 次。( 9 ) 滴加三抗， S A B C 3 7 0 C, 2 0 分钟. ( 1 0 )P B S 洗5 分钟3 次。( 1 1 ) D A B 显色。( 1 2 )复染。脱水，透明，封片。显微镜观察。3 . 2 对照 : 每次染色均设置阳性和阴性对照，用已证明C O X - 2 阳性的结肠癌石蜡切片作阳性对照，用磷酸盐缓冲液 ( P B S )代替一抗作阴性对照。4 . 酶联免
16、疫分析法常规采集静脉血后分离血清， - 3 0 保存待检。 C A 1 2 5 酶联免疫试剂盒由瑞士康乃格公司提供， 严格按说明书操作， C A 1 2 5 值用X 士S u / m l 表示。 C A 1 2 5阳性临界值为3 5 u / m l , 3 5 u / m l 为阳性。由我院妇科中心实验室测定。5 结果判定阳 性判断标准是细胞浆或细胞核出现棕黄色颗粒为阳性细胞。 染色强度分为0 - 3 级， 0 二 阴 性染色; 1 二 弱阳 性染色; 2 = 中 度阳 性染色; 3 二 强阳性染色。每 个 样本 所见的阳 性 细 胞范围 分 为0 - 4 级， 。 二 阴 性，1 二 阳 性细胞占1 %2 5 % ;2 二 阳性细胞占 2 6 % - 5 0 % ; 3 = 阳性细胞占 5 1 % - 7 5 % ; 4 = 阳性细胞占 7 6 % - 1 0 0 % e每张切片的评分以这两者之和表示， 0 - 1 分为阴性，2 分或以上者为阳性，其中2 分为 ( + )，3 - 4 分为 ( + + )，5 - 6 分为
