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1、分类号华中农业大学硕士学位论文达氏鲟微卫星分离及其亲子鉴定研究密级I s o l a t i o no fM i c r o s a t e l l i t eM a k e r so fD a b r y Ss t u r g e o na n da p p l i c a t i o ni ni t sP a r e n t a g eI d e n t i f i c a t i o n研究生：骆慧学号：2 0 1 0 3 0 8 1 1 0 0 8 3指导教师：危起伟教授指导小组：汪登强副研究员杜浩副研究员专业：湿地资源与环境研究方向：保护生物学获得学位名称：农学硕士获得学位时间：2
2、0 1 3 年6 月华中农业大学水产学院 二。一三年六月I U l lll l ln l lI II I I I I II IIY 2 3 9 4 4 9 3华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书学位论文如需保密，解密时间年月日是否保密舀独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的圊志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。研究生签名
3、：骆慧时间：矽场年易月叫日学位论文使用授权书本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容，为存在馆际合作关系的兄弟高校用户提供文献传递和交换服务，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力。注：保密学位论文( 即涉及技术秘密、商业秘密或申请专j f l l 等潜在需要提交保密的论文) 在解密后适用于本授权书。-、 学位论文作者签名：璐趋导师签
4、名：爰涉签名日期：卯乃年占月1 日签名日期：二习易年多月叫臼骆慧达氏鲟微卫星分离及其亲子鉴定研究目录摘要iA b s t r a c t i i第1 章文献综述l1 1 达氏鲟研究现状11 1 1 外部形态l1 1 2 分布及生境11 1 3 食性21 1 4 年龄生长21 1 5 洄游31 1 6 繁殖31 1 7 保护现状41 2 微卫星标记的简介51 2 1 微卫星的定义及类型61 2 2 微卫星标记的优缺点61 2 3 微卫星标记的应用81 3 亲子鉴定1 01 3 1 亲子鉴定的定义1 01 3 2 亲子鉴定的原理1 01 3 3 亲子鉴定的方法1 01 3 4 微卫星标记在亲子鉴定
5、中的应用1l1 4 研究目的与意义1 2第2 章达氏鲟微卫星文库的构建1 32 1 前言1 32 2 材料与方法1 32 2 1 实验材料1 32 2 2 主要仪器1 42 2 3 主要试剂1 42 2 4 基因组D N A 的提取1 5华中农业大学2 0 1 3 届硕士研究生学位( 毕业) 论文2 2 5 微卫星富集文库的构建。1 52 2 6 测序结果的分析及引物的设计1 92 2 7 多态性微卫星的筛选2 02 3 结果2 02 - 3 1 基因组D N A 提取2 02 3 2D N A 的酶切2 l2 3 3 菌落P C R 扩增检测阳性克隆2 22 3 4 微卫星引物的设计。2 2
6、2 3 5 多态性微卫星引物2 32 4 讨论2 7第3 章近缘物种微卫星标记对达氏鲟的通用性2 93 1 前言2 93 2 材料和方法2 93 2 1 实验材料2 93 2 2 实验仪器3 03 2 3 实验试剂3 03 2 4 基因组D N A 的提取3 03 2 5 微卫星引物3 03 2 6 微卫星引物的筛选3 03 3 结果3 23 4 讨论3 3第4 章达氏鲟亲子鉴定的研究3 54 1 前言3 54 2 材料与方法3 64 2 1 实验材料3 64 2 2 实验仪器3 64 2 3 实验试剂3 64 2 4 基因组D N A 的提取3 64 2 5 微卫星引物来源及荧光标记一3 7
7、4 2 6P C R 扩增3 8I l骆慧达氏鲟微卫星分离及其亲子鉴定研究4 2 7S T R 基因分型3 84 2 8 亲子鉴定分析3 94 3 结果3 94 3 1 荧光峰型图谱一3 94 3 2 亲子鉴定数据分析。4 44 4 讨论4 7参考文献4 9致谢5 9附录I攻读学位期间发表的论文及发明专利6 0附录I I攻读硕士学位期间参加的学术会议及课题组项目6 0I I I骆慧达氏鲟微卫星分离及其亲子鉴定研究摘要达氏鲟( A c i p e n s e rd a b r y a n u s ) 是我国特有的一种淡水定居性鱼类，由于人类活动的影响，其种群数量急剧下降，1 9 8 8 年被列为
8、国家一级重点保护动物，也是世界自然与资源保护联盟( I n t e r n a t i o n a lU n i o nf o rt h eC o n s e r v a t i o no fN a t u r ea n dN a t u r a lR e s o u r c e s ，I U C N ) 红色名录中的极度濒危( C r i t i c a l l yE n d a n g e r e d C R ) 物种。因此，有必要采取人工驯养、繁殖和增殖放流等技术及时有效地对该物种进行保护。本研究以达氏鲟为研究对象，开展微卫星标记的开发工作，力求为其遗传多样性的检测、遗传图谱构建和人工增
9、殖放流效果的评估等提供帮助；随后，利用所得标记进行了亲子鉴定的研究，为达氏鲟人工繁殖技术的优化提供了基础，这有助于为达氏鲟人工养殖群体的谱系建立以及种群遗传管理策略的制定提供了技术支持，也为其它鲟鱼的亲子鉴定提供了方法借鉴。研究结果如下：1 采用磁珠富集法构建了达氏鲟( C A ) 1 5 和( C T ) 1 5 微卫星富集文库并分离微卫星重复序列，设计了6 7 对引物在2 4 个达氏鲟个体中进行P C R 扩增，筛选得至1 1 2 6 对多态性引物。遗传信息分析显示，微卫星位点的等位基因数为3 1 3 ，平均等位基因数为5 2 ；期望杂合度( E x p e c t e dH e t e
10、r o z y g o s i t y , 玩) 范围为O 3 0 3 - - - 0 8 0 6 ；S h a n n o n - W i e n e r 多样性指数( 日7 ) 范围为0 4 8 0 , - - 1 8 9 3 。2 利用近缘物种微卫星标记的通用性，从湖鲟和铲鲟微卫星文库中筛选出应用较多的1 3 对引物，根据已公布的中华鲟E S T ( E x p r e s s e dS e q u e n c eT a g ) 设计4 0 对引物，共计5 3 个微卫星标记。将上述标记用于达氏鲟基因组D N A 的P C R 扩- 增，扩增产物经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，共筛选出1 5 对具有较高多态性的引物，通用率达到2 8 。3 从达氏鲟的微卫星文库和近缘物种的通用性标记中获得的4 1
