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1、论文评阅人1 ：评阅人2 ：评阅人3 ：评阅人4 ：评阅人5 ：答辩委员会主席：委员1 ：委员2 ：委员3 ：委员4 委员5 论文作者签名：指导教师签名：l 螋Y 2 4 2 12 7 2A u t h o r ss i g n a t u r e ：一 S u p e r v i s o r7 Ss i g n a t u r e ：T h e s i sr e v i e w e r1 ：T h e s i sr e v i e w e r2 ：T h e s i sr e v i e w e r3 ：T h e s i sr e v i e w e r4 T h e s i sr e v
2、 i e w e r5 ：rC h m r ：圣h 塑盟i 驾渔妲盟鱼璺墨Q 兰丝垒豇堑g 堕坠i Y 笪亟Y ( C o m m i t t e eo fo r a ld e f e n c e )C o m m i t t e e m a n1 ：R u i l a nG a o P r o f e s s o r Z h e i i a n gC h i n e s eM e d i c i n eU n i v e r s i t yC o m m i t t e e m a n2 ：J i m i nS h a o P r o f e s s o r Z h e i i a n gU
3、 n i v e r s i t VC o m m i t t e e m a n3 ：W e iL i u P r o f e s s o r Z h e i i a n gU n i v e r s i t yC o m m i t t e e m a n4 ：R e nZ h o u P r o f e s s o r Z h e i i a n gU n i v e r s i t yD a t eo f o r a ld e f e n c e ：2 0 1 3 5 1 2浙江大学研究生学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文
4、中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝鎏盘堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文储始乞夔鳓期：彤年，月，子日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解逝江盘堂有权保留并向国家有关部门或机构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝江盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：么圭签字日期：D 年厂月髟日
5、导师签名：签字日期加，弓年厂一月占日夕乙讹浙江大学博士学位论文致谢致谢回首近四年的博士生学 - - j 生涯，这是一个充满艰辛但又让人充实的阶段，这是人生中非常宝贵的时光，这个过程让我对科研和人生有了更深刻的认识。首先，衷心感谢我的导师来茂德教授。感谢您给我这次读博的机会，让我有机会学 - j 更多的知识和做人做事的道理，难忘师恩! 您求真求实、精益求精的科研态度深深影响着您的学生，您积极进取的人生态度感染着您的学生，您宽容豁达的气度让学生终生受教，在毕业之际，谨向我的导师致以我最崇高的敬意!感谢分子病理实验室的各位老师一徐芳英、张红河、徐恩萍、陈俭、盛弘强、邓红、黄琼、朱益民、张丹丹、胡虎、
6、吴晶晶、付颖、黄愉萍、谢灵丹、张帅、邱彬慧、陈芳等给予我实验及生活上的关心与照顾。感谢汪静宇对于本实验的鼎力相助，由衷感谢你的辛勤付出和无私帮助，生活中你乐观的态度也值得我学习! 感谢朱淑珍、王昊、王丽丽、李辉、叶美华、唐锦龙、李晨、孔建鲁、徐星字、钟安菁、张英琪、曹慧、冯梅宝、张婧、陆文汇、李有朝、饶翠、林山力、李振丽、虞旦、徐熙、张艳、徐春晓、袁浙萍、吕朵等同学给予我课题上的支持和多年来的快乐相伴。感谢师兄师姐李风英、马裕和林洁给予实验上的指导和帮助。感谢刘鸿、师帅等同学以给予我课题上的支持和帮助。感谢生化平台的李艳伟老师和孙明娇老师给予实验上的帮助。感谢浙江理工大学蛋白质组学与分子酶学研
7、究室的全体师生给予我读博期间的关心、支持和帮助，特别感谢赵辅昆老师多年来的关心和支持，您的教导使学生受益匪浅。最后我要感谢我的家人，谢谢你们无私的奉献，使我求学的路上充满了温馨和幸福。特别是在我内心脆弱的时候是父母和爱人的关心使我能鼓足勇气面对困难，你们的关心一直是我前进的动力!最后再次感谢所有关心和帮助过我的人们!谢谢大家!浙江大学博士学位论文中文摘要结直肠癌中R e g 生物学效应的研究浙江大学医学院病理学与病理生理学2 0 0 9 级博士研究生赵杰导师来茂德教授中文摘要结直肠癌是严重危害人类健康的常见消化道恶性肿瘤之一。在我国由于结直肠癌的发病率逐渐增加，并且其发病年龄趋向低龄化，因此人
8、们对结直肠癌发生机制的研究日益增加。腺瘤是结直肠癌发生的早期阶段，多数结直肠癌是从腺瘤癌变而来的，因此切除腺瘤可以有效地降低结直肠癌的发病率。然而，约3 0 4 6 的腺瘤患者在接受治疗后2 5 7 年内仍会复发，原因在于目前尚缺乏有效的指标来预测腺瘤的进一步演进或复发。因此对结直肠腺瘤发生机制的研究对于结直肠癌的预防及治疗具有重大意义。尽管人们对结直肠癌发生的分子机理进行了大量的研究，但至今结直肠癌的发生发展的分子机制仍不清楚。早在1 9 9 9 年，我们实验室应用抑制性消减杂交法( S S H ) ( 利用一个同时患有结肠腺瘤和腺癌的病例) 构建了三个e D N A 差减文库，在对腺瘤相对
9、于正常粘膜的差异片段文库( A _ N ) 分析时发现再生基因家族成员R c g l V 在腺瘤中相对高表达。再生基因( R e g e n e r a t i n gg e n e ，R e g ) 家族属于C 型植物血凝素超家族。该基因家族成员，均为小分子量的分泌性蛋白质，在结构上具有相似的钙离子依赖性血凝素结构域。它们与炎症、组织损伤修复、糖尿病及恶性肿瘤的发生发展有关。迄今为止，已经发现的人类R e g 家族成员一共有3 个，即R e gI ，R e g I I I 及R e g I V 。与其他人类R e g 家族成员不同的是，R e g l V 定位于第一号染色体上，而其余成员均I
10、 I浙江大学博士学位论文中文摘要定位于第_ - g - 染色体。但R e g l V - 与R e g 家族的其他成员在结构及功能上具有相似性。近年来人们已证实R e g l V 与结直肠癌的发生发展有关，然而R e g l V 在结直肠癌中的生物学功能及效应机制却研究的不多。为深入研究R e g l V 在结直肠癌发生发展中的作用，我们开展了以下两部分研究：R e g l V 在结直肠癌细胞中的生物学功能研究和R e g l V 在结直肠癌细胞中的效应机制研究。首先通过R T - P C R 和W e s t e r nb l o t 方法寻找R e g I V 阴性和阳性表达的结直肠癌细胞
11、系。实验结果显示R K O 和H T 2 9 为R e g l V 阴性表达细胞株，L o V o 和C W 2 为R e g I V阳性表达细胞株。然后我们分别转染R e g l V 表达质粒蛰 R e g l V 阴性表达的结直肠癌细胞内，通过G 4 1 8 筛选得到稳定表达R e g l V 的胞克隆，分别记为I O R e g l V 细胞株( R K O R ) 和H T 2 9 一R e g l V 细胞株( H T 2 9 R ) ，它们的对照组分别记为R K O C t r l( R K O C ) 和H T 2 9 - C t r l 细胞株( H T 2 9 C ) ；转染
12、R e g I V 干扰质粒到L o v o 细胞株中，同样通过G 4 1 8 稳筛R e g I V 稳定干扰的细胞克隆L o V o R e g l V s h R N A 和它的对照组细胞克隆L o V o C t r l s h R N A ；用s i R N A 片段瞬时干扰C W 2 细胞中R e g l V 的表达，它的R e g l V 干扰的细胞记为C w 2 s i R N A R e g I V ，对照组细胞记为C W 2 一s i R N A - N C 。获得R e g l V 稳定表达干扰的细胞克隆后，我们对这些细胞克隆进行生物学功能研究，通过E d U 法、x C
13、 E L L i g e n c e 系统及C C K 8 力-检测R e g l V 表达干扰前后细胞增殖能力变化，未发现R e g I V 具有促进细胞增殖的能力；通过外源性R e g I V N 激细胞后同样发现R e g l V 未具有促进细胞增殖的能力；我们又利用流式细胞术检测细胞周期，结果显示并无显著差异。利用5 - F U 诱导细胞凋亡，分别在2 4 小时和4 8 小时检测细胞的存活率，发现这几组细胞的存活率也无明显差异。通过T r a n s w e l l 4 、室和x C E L L i g e n c e , 系统检测N R e g l V 表达组细胞的迁移能力均强于它们
14、的对照组细胞；N R e g I V 干扰组细胞的迁移能力比它们的对照组细胞有所下降。利用铺有M a t r i g e lf f 寸T r a n s w e l l 小室检测细胞的侵袭能力，发现R e g l V 表达组细胞的侵袭能力强于它们的对照组细胞，干扰组结果反之。综上知R e g V有促进结直肠癌细胞迁移和侵袭能力，但未见对结直肠癌细胞的增殖和凋亡有影响。因此探索R e g I V i v 何诱导结I I I浙江大学博士学位论文中文摘要直肠癌细胞迁移和侵袭的分子机制是我们下一步所要开展的工作。比较蛋白质组学是当今生物学研究的一个重要领域，比较不同生理和病理状态下细胞内蛋白质表达和蛋
15、白质修饰，对于揭示生物系统的复杂生理和病理过程具有十分重要的意义。同位素标记相对和绝对定量( i s o b a r i ct a g sf o rr e l a t i v ea n da b s o l u t eq u a n t i t a t i o n ，i T R A Q ) 技术是近年来最新开发的一种新的蛋白质组学定量研究技术。i T R A Q 技术结合先进的液相色谱一质谱联用仪( 1 i q u i dc h r o m a t o g r a p h y- m a s ss p e c t r o g r a p h ，L C M S ) 对蛋白质样本的分离能力强、分析范
16、围广、灵敏度高、可同时对多个样本进行平行分析并可以绝对和相对定量，因此i T R A Q 技术结合L C M S 必将成为一种功能更强大的蛋白组学研究方法。因此我们选用i T R A Q 标记的比较蛋白组学方法来探索R e g I V 在结直肠癌细胞中的效应机制，我们用该方法完成了对1 9 8 5 种蛋白质的定量分析。已鉴定出的表达量上有差异的蛋白质是否最终被筛选和认定为差异蛋白质，还需要进行统计学的验证。由于R K O 和H T 2 9 细胞本身遗传背景不同，因此它们所得的差异蛋白质结果也存在差异。通过统计学分析后，所产生的差异蛋白质的筛选结果如下：R K O R R K O C 组鉴定出6 个显著下调和1 1 个显著上调的蛋白质，H T 2 9 R H T 2 9 C 组鉴定出1 8 个显著下调和1 3 个显著上调的蛋白质。因为肿瘤的转移过程是多基因、多途径的过程，因此不同遗传背景的细胞所得的实验结果可1 ) f 1 羹R e g l V 分子机制研究提供更多的信息和线
