《肌小节Z线蛋白Cypher泛素化降解的初步研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《肌小节Z线蛋白Cypher泛素化降解的初步研究（60页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、丛! 芷丝绫蛋自Y 卫塾里! 湮盍丝隆簋鲍翘生珏究论文作者签名：翌翘指导教师签名：左堑鱼篓论文评阅人1 ：评阅人2 ：评阅人3 ：评阅人4 ：评阅人5 ：答辩委员会主席：委员l ：委员2 ：委员3 ：委员4 ：委员5 ：答辩日期：2 Q1 31 51 2 9浙江大学研究生学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得迸江盘鲎或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者
2、签名：彳釉签字日期- - 扩l 年s 月弓J 日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解逝鋈盘堂有权保留并向国家有关部门或机构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权迸姿盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：尹签字日期：砂 ；年亨月弓J 日导师签名：7 勿哆 1 5 ) 。( 5 ) 将步骤4 中的培养物转到加有Y P D A 培养基的锥形瓶中，继续扩增酵母细胞。( 6 ) 3 0 ，2 3 0 - 2 7 0r p m ，直到使O D
3、6 0 0 达到0 5 0 1 ( 需要31 1 r 左右) 。( 7 ) 把细胞转到新的5 0m L 的离心管内，转速大约l0 0 0g ，离心5m i n 。( 8 ) 弃去上清，加入2 5 5 0 m L H 2 0 ，轻轻混匀重悬、清洗后收取细胞。( 9 ) 转速10 0 0g ，室温离心5m i n ，弃上清( 1 0 ) 加入1m L 无菌的1 XT E L i A C ( 现配现用) 重悬细胞。( 1 1 ) 使用1 5m L 无菌的E P 管，在每管中加入需要转染的质粒D N A 。3 1 2 检测诱饵蛋白的表达以及自激活活性和毒性a ) 检测诱饵蛋白的表达通过W e s t
4、e r nB l o t 检测，具体步骤见后述W e s t e r nB l o t 步骤b ) 检测诱饵蛋白的自激活1 所需材料p G B K T 7 - B a i t 质粒Y 2 H G o l d 酵母菌株浙江大学硕士学位论文试验方法S D - T r p X a - G a l 琼脂平板S D - T r p X a - G a l A b A 琼脂平板2 将1 0 0p l1 1 0 稀释以及1 1 0 0 稀释的转化菌株分别置于下述平板中：S D - T r pp l a t e s2S D OS D - T r p X a G a l = S D O Xp l a t e s
5、S D - T r p X a G a l A b A = S D O X Ap l a t e s3 3 - 5 天后观察结果S a m p l eS e l e c t i v eA g a rP l a t eD i s t i n c t21 T i mC o l o n i e sC o l o rB a i ta u t o a c t i v a t i o nt e s tB a i ta u t o a c t i v a t i o nt e s tB a i ta u t o a c t i v a t i o nt e s tP o s i t i v ec o n t
6、 r o IC ) 检测诱饵蛋白的毒性S D OS D o ，XS D O X AD D o ，X A分别将下述质粒转化酵母菌株对照：p G B K T 7 ( 空质粒)Y e sY e sN oY e s鼢i r e西西i t eo rP a l eB l u eN ，AB l u e实验：p G B K T 7 + 克隆的基因将1 0 0p 11 1 1 0 稀释以及1 1 0 0 稀释的转化菌株分别置于下述平板中：S D - T r p3 0 培养3 5 天，如果诱饵蛋白有毒性，会发现长出的克隆与空质粒相比明显的小很多。3 1 3 对照实验曲所需材料1 培养琼脂平板及培养基S D - T
7、 r pS D - L e uS D - T r p X - a - G a i1 4浙江大学硕士学位论文试验方法S D - L e u - T r p X - a - G a l A b A2XY P D A 液体培养基Y P D A 液体培养基+ 2 5 甘油2 培养用菌株Y 2 H G o l dY e a s tS t r a i n ( B a i tS t r a i n )Y18 7Y e a s tS t r a i n ( P r e yS t r a i n )3 质粒p G B K T 7 5 3p G B K T 7 - L a mp G A D T 7 一Tb ) 实
8、验步骤P o s i t i v eC o n t r o lB a i tP l a s m i dN e g a t i v eC o n t r o lB a i tP l a s m i dP o s i t i v eC o n t r o lP r e yP l a s m i d( 1 ) 在无菌的1 5m LE P 管，加入0 5m L2x Y P D A 培养基。( 2 ) 分别挑取直径约2 3r a i n 、新鲜的酵母克隆( 含表达质粒) 于以上E P 管中。阳性对照：p G A D T 7 T + p G B K T 7 5 3 ，其中T 蛋白和5 3 蛋白是已经明确在
9、酵母细胞内能够发生结合并启动报告基因表达的两种蛋白。阴性对照：p G A D T 7 T + p G B K T 7 1 a m ，其中已经明确T 蛋白和l a m 蛋白在酵母细胞内不能发生结合。( 3 ) 剧烈震荡1m i n ，使酵母细胞完全悬浮。( 4 ) 3 0 ，2 0 0r p m 振摇孵育2 0 - 2 4h 。( 5 ) 将杂交混合液按1 比1 0 ，l 比1 0 0 ，1 比1 0 0 0 稀释，取1 0 0 _ t 1 分别涂布到以下培养板中，3 0 ，3 5 天S D - T r pS D - L e uS D - L e u - T r p ( 2 D D O ) 1
10、5浙江大学硕士学位论文试验方法S D - L e u - T r p X - a - G a l A b A ( = D D O D U A )阳性对照结果：1 D D O 培养板与D D O X A 培养板有大致相同的克隆数2 D D O X A 培养板的克隆是蓝色阴性对照结果：D D O 培养板有克隆长出，D D O D U A 培养板无克隆生长3 1 4 酵母双杂交( 1 ) 挑取一新鲜、直径为2 3i l l n 的B D - b a i t 酵母Y 2 H G o l d 于5 0m lS D 一T r p 液体培养基，3 0 ，2 5 0 2 7 0r p m ，1 6 , - -
11、 2 0 小时，培养至O D 6 0 0 值 0 8 。( 2 ) 1 , 0 0 0 g 离心5m i n ，弃上清。用剩余的5m L 左右残液重悬细胞。注意：此时细胞密度要 1x l O8 个m l( 3 ) 室温水浴融化冻存的文库( 约1m L ) ，轻柔震荡，留取1 0 “L 文库用于文库滴度测定( 4 ) 快速将步骤2 和步骤3 的两种液体混合到2L 的烧瓶中并加入4 5m L2 X Y P D A 液体培养基( 含K a n 5 0I t g m L ) 轻柔震荡；用lm L2 x Y P D A 冲洗装文库的离心管两次，并将冲洗液加入到烧瓶中。( 5 ) 3 0 过夜孵育( 2
12、0 2 4h r ) 并轻柔震荡( 3 0 5 0r p m ) 。( 6 ) 将杂交混合液转移到一无菌离心瓶中，1 , 0 0 0 g 离心1 0m i n ，弃上清。再用5 0m L2 x Y P D A 液体培养基冲洗杂交瓶两次，将两次冲洗液混合在一起重悬细胞。( 7 ) 1 , 0 0 0 g 离心10m i n ，弃上清。用1 0m L 的0 5 x Y P D A 重悬细胞，并估算重悬后的总体积，铺板。( 8 ) 倒置平板于3 0 孵育8 , - - 2 1 天直到克隆出现。( 9 ) 挑取阳性克隆于3 0 0p LY P D A 和1 5 0p L 消毒甘油的混合液中，冻存于一8
13、 0 。阳性克隆验证：( 1 ) 用接种环挑取单个阳性克隆接种到新的S D T r p L e u - H i s X G a l 平板上，3 0 倒置平板孵育。浙江大学硕士学位论文试验方法( 2 ) 待阳性克隆长出后，再用接种环挑取单个阳性克隆，接种到新的S D - T r p L e u H i s X - G a l 平板或S D T r p L e u A d e H i s X G a l 平板上，倒置平板于3 0 孵育。( 3 ) 挑取单个阳性克隆于5m LY P D K a I l 培养基中3 0 ，2 5 0 - 2 7 0r p m 振摇1 2 - 1 6h r 。( 4 )
14、 使用酵母质粒微量抽提试剂盒提取质粒。( 5 ) 将提取到的质粒混合物( B D b a i t 、A D c D N A ) 转化D H 5 e t 大肠杆菌，铺L B抗生素平板。L B 平板中的抗生素与A D c D N A 载体所带的抗性一致，这样最终得到的克隆只含有A D c D N A 。( 6 ) 挑取单个阳性克隆于5m LL B 培养基( 含相应抗生素) 中3 7 ，2 5 0 2 7 0r p m 振摇1 2 1 6h r 。( 7 ) 提取质粒，做P C R 鉴定，测序( 8 ) 将p G A D T 7 一c D N A 表达质粒转入Y 1 8 7 酵母株中，将p G B
15、K T 7 一b a i t 表达质粒转入Y 2 H G o l d 酵母中，待克隆长出，对带有A D 文库蛋白的Y 1 8 7 酵母克隆进行自激活验证，另外再将带有A D 文库蛋白的Y 1 8 7 酵母克隆与带有B D b a i t 蛋白的Y 2 H G o l d 酵母克隆进行杂交，验证阳性克隆的真实性。3 2C y p h e r 突变体的泛素化降解3 2 1C y p h e rC C S R 片段的构建a )构建C C S R ( A A l 0 8 2 2 7 )上游引物：G A T C T G G T T C C G C G T G G A T C C G A C C C T
16、G C T C T G G A c A下游引物：7 I v r T A A T A A G A T C T G G T A c c T c A C C C T C C T A G G A G T C C A GP C R 反应体系： 模板02“l1 0 b u f f e r5U ld N T P ( 2 m Me a c h )5 1M g S 0 4 ( 2 5mM)4山上游引物3 1下游引物3g l1 7浙江大学硕士学位论文试验方法K O D P l u s 酶1mD M S O4 斗ld d H 2 02 4 8g l共5 0 山P C R 条件：9 4 。C 预变性2 m i n ，9 4 。C1 5 s ，5 5 。C1 5 s ，7 2 。C6
