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1、分类号：1 1 2 0 3 1密级：学位类别：科学学位口专业学位口学校代码：学号：学科门类：lO0 622 0 1 0 6 0 2 7 1 8医学 夭洱酱科六垮 了l A 鞫J I N 酗菱D l e A 薹_ U 鞫l V E R S l 鼍1硕士学位论文M A S T E R SD I S S E R T A T I O N论文题目：活血开窍汤对大鼠脑缺血再灌注损伤N O含量及细胞凋亡的影响TIT L EE f f e c to fH u o X u e K a i Q i a o d e c o c t i o no nt h eN Oc o n t e n ta n dc e l la
2、 p o p t o s i si nm o d e lr a t sw i t hc e r e b r a li s c h e m i a r e p e r f u s i o nl n j u r y一级学科：中西医结合二级学科：中西医结合临床论文作者：张丽丽指导教师：李平天津医科大学研究生院二。一三年五月学位论文原创性声明I III I MM I H I I II I I I IU l U l I I I IY 2 3 9 6 4 7 0本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个
3、人或集体己经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：袭压翻R 期：纠拜r 月? 9 日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。本论文属于保密口，在年解密后适用本授权书。不保密区Z( 请在相对应的方框内打“”)学位论文导师期：功B 铉膨日期：训弓铽黟日天津医科大学硕士学位论文中文摘要背景与目的脑血
4、管病是严重威胁人类尤其是中老年人健康的常见病、多发病，具有高发病率、高致残率和高致死率的特点，其中7 0 8 0 是缺血性脑血管病I lJ 。脑缺血再灌注损伤是缺血性脑梗死区在血液供应恢复后出现的更严重的脑损伤，其损伤发生机制比较复杂，抑制再灌注损伤是治疗缺血性脑血管病的重要环节。尽管国内外研究者对此进行了大量的研究并取得一定进展，但仍缺乏有针对性的治疗策略【2 j 1中药治疗缺血性脑血管病已有悠久的历史，具有疗效确切、不良反应少、药理作用广泛等优点，可以从多个层次和多个环节上起到保护作用，特别适合脑缺血所致的多种病理改变，日益引起医学界的关注1 4 J 。活血开窍汤是导师李平教授治疗缺血性脑
5、卒中的经验方，该方由天麻、牛膝、寄生、远志、葛根、川芎、地龙、丹参、赤芍组成，具有活血开窍、补肾通络的功效。多年来的临床实践证明，此方在治疗缺血性脑卒中方面确有疗效。本实验研究通过观察缺血再灌注大鼠脑组织中N O 含量和神经细胞凋亡数的变化，探讨活血开窍汤对大鼠脑缺血再灌注损伤保护作用的机制，进一步为临床用药提供理论和实验依据，以便推广应用。方法本课题采用W i s t a r 雄性成年大鼠作为实验动物，研究活血开窍汤对局灶性脑缺血再灌注损伤的保护机制。将大鼠随机分为空白对照组、假手术组、模型组、活血开窍汤治疗组。各组在相同条件下分笼喂养，实验开始第一天起给予治疗组活血开窍汤2 2 9 l O
6、 O m g d 灌胃，假手术组和模型组分别给予等量的生理盐水灌胃，各组每天灌胃1 次，连续灌胃给药5 天。至造模成功后继续重复手术前的给药方式致指定时间点。末次灌胃给药后2 h 根据改良的Z e a L o n g a 1 线栓法制作大脑中动脉栓塞( m i d d l ec e r e b r a la r t e r yo c c l u s i o n ，M C A O ) 模型，9 0 m i n 后实施再灌注。分别于再灌注后2 4 h 、4 8 h 快速将大鼠断头处死，完整剥取大脑组织，其中每组的半数制成脑组织匀浆液用于N 0 检测，另半数采用心脏灌注的方法固定大脑，用于染色以观察
7、细胞凋亡和病理变化。将脑组织匀浆液天津医科大学硕士学位论文标本采用硝酸还原酶法测定N 0 含量，严格按试剂盒操作步骤完成。将用多聚甲醛固定的脑组织标本采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口术端标记( T U N E L ) 染色法检测神经细胞凋亡数。高倍镜下观察，细胞核内棕黄色为阳性细胞，分别选择5 个高倍视野计数T U N E L 阳性标记细胞，计算平均每个高倍视野下1 0 0 个细胞中的阳性细胞数。运用H E 染色方法观察活血开窍汤对脑缺血损伤的组织形态学改变。结果：经实验观察，活血开窍汤治疗组大鼠缺血再灌注2 4 h 、4 8 h 后，病理显示模型组大鼠的脑组织神经细胞损伤数目较多，且损
8、伤严重，而治疗组显示神经细胞损伤程度明显较轻。经测定，模型组大鼠脑组织中N 0 的含量及神经细胞凋亡数明显升高( P 6 h ) ，i N O S ( 诱导型) 产生的N O 对迟发性进行性神经元损害起主要作用。本实验检测的是脑缺血9 0 m i n 再灌注2 4 h 、4 8 h 的N O水平，从时问上看，此时的N O 主要由i N O S 产生，对神经损害起重要作用。本实验结果显示，脑缺血9 0 m i n 再灌注2 4 h 、4 8 h 后，脑组织N O 含量明显增加f p 0 0 1 ) ，但说明此时的N O 确实参与了脑缺血再灌注损伤的病理生理过程，对脑缺血再灌注损伤起促进作用。实验
9、结果还显示，活血开窍汤治疗组大鼠脑组织中N O 含量均较模型组降低( p O 0 5 ) 。该结果提示脑缺血再灌注损伤后，活血开窍汤能有效地降低局灶性脑缺血再灌注脑组织中N O 的含量，从而抑制N O 介导的神经毒性作用，这可能是活血开窍汤防治脑缺血再灌注损伤的机制之一。4 3 3 活血开窍汤对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织细胞凋亡的影响随着近年来对细胞凋亡概念的逐渐认识以及对缺血性脑损伤与细胞凋亡关系的研究，目前比较一致地认为缺血性神经元的坏死与凋亡两种形式并存，共同参与缺血性脑损害的形成【5 外，坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程，以细胞迅速肿胀和崩解为形态特
10、征，随着胞质内蛋白变性、凝固和碎裂，核蛋白的降解，细胞内结构完全消失，细胞内容物流出，引起周围组织炎症反应。坏死一般位于缺血核心区。细胞_ ：N 1 2 ( a p o p t o s i s ) Y 称为细胞程序性死亡( p r o g r a m m e dc e l ld e a t h ，P C D ) 是由于细胞内外因素激活细胞本身自杀性程序而引起的一种细胞死亡形式。脑缺血可以导致神经元以坏死或凋亡的机制缺失。已经证明凋亡在局灶性缺血再灌注损伤的神经元死亡中有着重要作用，尤其在缺血半暗带。从形态学而言，半暗带区是梗塞灶周围的脑组织，2 4大津医科人学硕士学位论文虽然部分功能受损、但仍
11、为可逆性修复的脑组织【6 ，与梗死灶的发展扩大有关，可能决定了最终梗死体积1 6 1 | 。细胞凋亡在病理和生化方面与细胞坏死明显不同。细胞凋亡主要的形态学特点是核内染色质固缩，致密度提高，细胞器密集，胞核出现明显的皱缩、不规则，核糖体从粗面内质网上消失，随着细胞核的变化，细胞膜和细胞质也发生改变，相邻细胞问连接复合体普遍消失，失去微绒毛等细胞表面特殊结构，当细胞膜结构仍然保持完整，线粒体仍保持完整呈F 常状态，细胞质浓缩，细胞体积变小甚至小于正常细胞直径的1 3 ，内质网、高尔基复合体及核被膜膨大，形成泡状结构与胞膜融合，以出泡方式离丌正在死亡的细胞，将所包含的完整细胞器和核碎片等由细胞质膜
12、包被成凋亡小体释放到胞外，逐渐被周围邻近的巨噬细胞或小胶质细胞吞噬，由于细胞内的成分不外溢，因此并不引起周围组织的炎症反应，完成凋亡过程。形态学分析是鉴定细胞凋亡最直接的方法，主要是借助光学显微镜和电子显微镜对细胞或组织进行各种染色。本实验利用T U N E L 方法观察缺血再灌注大鼠神经细胞凋亡数，以及活血开窍汤对神经元凋亡的影响。结果显示，模型组缺血再灌注后，缺血侧的脑组织可见较多阳性表达的凋亡细胞，活血丌窍汤组在相同区域也同样观察到阳性表达的凋亡细胞，但是与模型组相比阳性率明显下降( p 0 0 1 ) ，实验结果证明，活血丌窍汤抑制缺血后细胞凋亡的发展，延缓或阻止缺血区域神经细胞的死亡
13、进程，一定程度上挽救受损的神经元，从而防止梗死病灶的扩大。脑缺血再灌注损伤可诱导神经元的凋亡，细胞凋亡与许多机制有关，如自由基作用、钙超载作用、线粒体损伤及基因调控等，但确切的机制还不清楚。从本课题研究结果可以看出，细胞凋亡参与了脑缺血再灌注病理损伤过程，活血开窍汤可通过预处理给药的方式，抑制了大鼠缺血再灌注后大脑神经细胞凋亡数，对脑缺血再灌注损伤有明显的保护作用。由于时间有限，本课题对引起细胞凋亡的其它机制未能进行研究，脑缺血再灌注损伤后是否影响了凋亡相关基因，如C a s p a s e 家族、B c l 2 家族、p 5 3 等基因的诱导和表达，而导致神经元细胞凋亡，活血开窍汤是否能通过
14、影响凋亡相关基因的表达或其他机制而对脑缺血再灌注损伤起保护作用，这都是有待进一步研究的课题。天沣医科大学硕士学位论文结论耋日F 匕卒中后引起的缺血再灌注损伤是脑卒中造成的重要损伤之一，是一个多环节、多因素、多途径损伤复杂的病理生理过程，中药具有多方面的神经保护作用，现己广泛应用于临床，具有多靶点、多向调节、防治结合的临床意义，且安全性高、不良反应少、改善临床症状快、可降低致残率，有望成为一种较为有效的神经保护药物。本实验采用线栓法制备局灶性脑缺血再灌注大鼠模型，观察中药活血丌窍汤治疗实验性脑缺血再灌注损伤大鼠的效果，并探讨其可能的作用机制，通过本实验研究初步得出以下结论：( 1 ) 活血丌窍汤
15、能改善缺血再灌注损伤2 4 h 、4 8 h 动物模型的神经细胞损伤的作用。( 2 ) 通过硝酸还原酶法方法发现活血丌窍汤能减少缺血再灌注大鼠脑组织中N O 的含量，可见活血开窍汤可能通过抑制N O 的过度表达而起到脑保护作用。( 3 ) 通过T U N E L 法测定缺血区域凋亡阳性细胞数，发现治疗组神经细胞凋亡数明显降低，因此我们认为活血开窍汤对脑缺血后细胞凋亡的抑制作用可能是其保护作用的重要组成部分。脑缺血再灌注损伤的机制与多因素相关，各因素相互影响，互为因果。本实验选取其中两个可能的损伤因素验证了活血丌窍汤对缺血再灌注损伤的保护效应，为其对脑卒中治疗机制的研究提供了实验依据，同时为活血
16、开窍汤的临床应用提供客观理论依据。而活血丌窍汤能否通过其他机制发挥其神经保护作用，是有待进一步研究的课题。2 6天津医科大学硕士学位论文参考文献【1 C a n d e l a r i o - J a l i lE I n j u r ya n dr e p a i rm e c h a n i s m si ni s c h e m i ct r o k e ：c o n s i d e r a t i on sf o rt h e d e v e l o p m e n to fn o v e ln e u r o t h e r a p e u t i c s J C u r rO p i nI n v e s t i gD r u g s 2 0 0 9 ，10 ( 7 ) ：6 4 4 6 5 4 【2 C h r i s t o p h eM ，N i c o l a sS M i t o c h o n d r i a ：at a r g e tf o rn e
