《CVFBAC5和’131IBAC，5联合靶向治疗鼻咽癌的体外实验研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《CVFBAC5和’131IBAC，5联合靶向治疗鼻咽癌的体外实验研究（62页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、中山大学硕士学位论文CVF-BAC和I-BAC联合靶向治疗鼻咽癌的体外 实验研究姓名：杨星申请学位级别：硕士专业：病理与病理生理学指导教师：杨惠玲;刘长征2003.5.30a 罄最曦帮b 魏 Q 联台鞑寓燕荇赛饕穗嚣靠静实赣研究C V F - B A C s 和1 3 1 L B A C 5 联合靶向治疗鼻咽癌的体外嶷验研究硕士研究盛：杨星 导师；杨惠玲教授、刘长征激授摘要， ( 鼻咽癌( n a s o p h a r y n g e 韬dc a r c m o m a m a ，N P C ) 是我国潲方常见的恶性肿瘤之一，龙其浚广裹豫选兰煮溺及嚣敬滚壤萤发痣率最蹇，严鬟危害了久民懿链糜。
2、瓣蘸彝嚆癌牺床上应用的主黎治疗手段怒放瓣治疗。毽捧为局部治疗筝段，串随麓治疗效果差，艇发率及远她转移率高，长期生存率低。要提高鼻咽癌患者的5率生存率襄生存矮量，还嚣不蘩寻求薪麴溪疗手段，增强赞对翳瘿绷魏魏选择挫张特异性杀伤，以运至综合治疗。近几十年来，肿瘤生物治疗为目前肿瘸治疗研究阡辟了新领域。利用针对特嚣彀辩瘗耪关挽豢豹荤克豫撬律终秀载体，筑敷鬈彀挟素、毒素、忧疗莼麴稼为“弹头”的毒憔效应分予，梅建的抗耱瘸免疫偶联糁( I m m u n o c o n j u g a t e ) 是爵黼肿瘤导向治疗研究的重麟方向。联合成用免疫毒索_ 栩放射免疫偶联物，利用射线冬毒素之溺举弱魏辩瘙佟爆穗翻豹
3、互羚，挺裹荸独攫蘸弱蠡瓣瘸教成。著提舞局部肿瘤缀级酌放射线帮毒索的浓度，减少了全骞毒髓和菲靶器富黪旅射程稷射。为单克隆抗体联合导向治疗展现出广阔的前景。羧凌瞎毒强予( c o b r av e n o mf a r 1 0 r , C V F ) ，选穗抗毒 蒋蛋鑫( a n t i c o m p l e r n e n tp r o t e i n C P ) 鼹从眼镜蛇凑中提取出的补体C 3 在臻擒和功能土的类似裙，僵涨对抗H 、I 园子的灭活，血浆半衰期长，豹为7 小时，闭此能不断辩路激活补体。C V F 毒其它拇建免疫毒素熊弹头懿簿褰襞蓦耪) 鞠隗：( 1 ) 它冤豢经絮憨内化，不象
4、其他潆紫必须迸入细胞内才能激挥毒性作用。它通过在靶跚脆周匿聚熬，糕胞外不断漱错补体系统，形成膜攻击嶷台物，达到损伤靶细胞的作用。( 2 ) 嚼发簿爨惹庆蠡终震是藏靠奔尊瘩圭藩斑黥李 蒜系统激活，零奏无毒健，镬嚣安全；目前，国内外学者己报道避掰异型双功虢交联剂3 ( 2 - 蹴淀乙彗) 丙酸N 璃璃躐溉胺酯( S P D P ) 将C V F 与相应的单施隧抗体偶联，在体外实黢对黑色素瘸、漤器瘥，彝爨鸯缁藏瘩、绻鼹瘗、鑫蠡瘸，彝曦鏖等转瘸绥燕拣驽显汞莓瓣爨终HC V F - B A C s 翩瑚 - B A C s 联合靶瓤潍睁彝醒癌前讳井礴赣研究尾。堡媸S P D P 交联，C V F 的活性
5、下降涛单体C V F 鸵2 & 3 0 。Q i n g l 8 珏F u 首先 擐遭了弼3 - ( 2 - 髋夔己基) 丙酸瓣蘸 D 翳援联C V F 帮O V B * 3 萃撬，薅联率为3 0 4 0 ，偶联物C V F 的活性为单体C V F 活性的7 0 7 5 。目前尚无用P D P H 偶联C V F 与警抗梅建的兔疫毒素进行髂蠢器挪瘿幸誊焉翦报道。寤来觅利用P D P H瘸联C V F 稚彝疆癌攀克隧抗蒋静掇滋。1 3 1 1 魁临床上应用予放射治疗煅昂最常用的般射性核素之一，即可用乎核素渍疼杀伤艘瘗缨鼹，又蕊翅子髂蠹瀑黥耧放射瞧爨显影。嚣盈b l l 标避蛋盘方法简易、完蛰，应
6、弼范礴广，标毫率黼。B A C s 憝骶静往彝磴瘫耀瑰表蟊鞠美抗原单克隆抗体，是由肖铹疑等按杂交瘸技术制各筒米。寸本漂趣撅努鬟携建m l 标记熬戳惦5 雾震P D P H 捺C V F 稿联B A C s ，鹚搽联台痤需珏1 I - B A C 5 和C V F - B A C 5 钵辨靶雨季枣稠彝潮痨密穗煎舔髑。为彝疆瘀魏导向治疗提供一条新的思路。f 奉实验彗宠采焉S c p h a d e xG ? 裂l 蓐x 3 涎螂分子筇瑟梃挫分离窭4 令蜂，经抗补露寇懿实验只有菊l 、2 蜂有抗补体活缝。秀收熊第l ，2 酶避Q S e p h a r o s e F a s tF l o w 缝黼
7、予梯度洗脱，洗脱出5 个峰，其中只有篇4 个峰有抗补体活性。收集著浓臻趣滤交薤螽，经1 0 S D S - P A G E 毫鼗鉴定，喾还原条件下，呈一条主锴还原条件下，里三条主带。三个亚单位a = 3 7 。7 k d ，= 4 8 。2 k d - V = 6 6 9 k d ，慧分子量为1 5 2 8 k d 。活性测定其一个抗补体单位为2 5 8ug 一个溶血雌位隽5 + 3 51 tg ，与嚣蠹辩喜关C V F 戆擐遂桴儆。采惩鼹雾注分离掇缝C V F ，既能效果基本满意，满怼了下一步偶联实验妥承的纯度裔，浓度高，体积小的特点。每次上样量为2 9 ，熏复性好，层析周期仪需秀天。C V
8、 F 兜在半乳糖裁纯酶( g a l a e t o s eo x i d a s e ) 、辣撮过氧化酶静作搿下，C V F 寡聚糖链末端的半孥L 糖残基上C 6 位的羟基被还原成醛基，褥与P D P H 遮撩，爱鏖混合穆立霹薅S e p h a d e xG - 2 5 缝化，去狳游离懿P D P H 。C V F 毒P D P H 崧爱 应物中豹投八量比为1 ：1 0 0 。e - - - 硫苏糖醇还原鉴定，l m o l C V F 上海接了2 3 8 9 m o l 的P D P 。B A C 5 与2 亚甄蒸四氢噻吩( 2 I T ) 以1 ：1 2 0 比例混合e在B A C 魏
9、氮基主雩l 入巯基。与其稳萼l 入蓊萋静努法耱滋，它不黪噙蛋白鹱鹩撵型，保留了原有的生物活性。反应宛毕，须立邵粥心超滤去豫游离的2 I T ，经I HC V F - B A C s 秘嘲b 黼岛联台糍辩j 蠹帝霹瑙瘗耪蒋静察鞋鞲巍E l l m a n 试剂( D n m ) 还原鉴定，l m o lB A C s 上涟接了4 5 m o i 的一S H 。浓缩后的B A C 5 S H 迅穗每C V F - P D P 璐1 ：1 等鬻象逡爱瘢。鬣遴完嚣怒滤浓续。采懑7 , 5 S D S - P A G E 滚定发庭鹈联携，毒黧蹇势予量戆C V F 转A 岛褒联携的条带。通过凝胶成像系统分
10、析，测定偶联率为58 1 。经多次偶联反应观察，P H 建爨爱盛糍戆滚菠爨影噙轰盛鬟联攀戆耋要瓣素。在滚魔宠瓣条终下，P H镶为8 0 瓣，C V F - P D P 鸯B A C 5 - S H 熬藕联辜较糍。强P H 蘧一定懿条静下，撬辫反应物的浓度，可搬高偶联反应的偶联翠，但同时，生成高聚物( 如2 ：1 ，1 ：2 ，2 ：2 ) 懿魄镶褰袭熬。蘩蔫溶纛赛虢蕤定C V F - - B A C 5 懿溶蠢活性，鹱褒褥黪一令溶纛攀使势1 5 。薹毒# g ，等摩承瓣稻凝麴黪潦纛瓣链丈鹭舞C V F 貔7 0 + 8 0 。缎L S A B 法撩定偶联物的免疫活性，lr e g i n a
11、的偶联物的免癀滴度为1 ：3 2 7 ，6 8 0 ，1m g m l B A C 5 蠹擘毙袋潴凌隽l ：2 ，9 1 2 ，7 0 0 + 缡赣鞠妻冬兔疫溪瞧大懿魏等簿尔鼗嚣A e 5 豹2 程* 3 0 。用氯胺T 法”1 I 标记B A C 5 ，橼记率t9 8 3 ，放射化学纯庶9 5 3 6 ，放鸯孛缝滚爱：_ 毒2 1 x 1 0 7 B q m l ，藏射瞧魄潘凝；l 。l l x l 0 糊m o l ，M 鞭法躐察各魏疫稻联褥辩C N E 2 缁瓣瓣稚瘸俸耀。( 1 营纛瓣较C V F 。B A C s 和C V F 对C N E 2 细胞的抑制效应。缩聚熙示：在新鲜人血清
12、存在的条箨葶，燕芬撩1 2 零辫、勰枣薄、霉8 枣辩，努籍疆浓度瓣羧蕊瓣璜燕，麓辩黪巷l 率垒绫穗增辩趋势。翻蕊螽】2 小露、瓣夸辩、霹8 夺髓，I C s o 努勇l 为1 9 x 1 0 o l L ，2 。1 x l O - 6 m o l L ，2 2 x 1 0 6 m o l L 。耀同浓度剂嫩梯发的C V F 在新鲜人戚清存在下，对C N E 2 缫蕤撵懑1 2 零对，2 4 夺鼙事，4 9 枣薅瓣冀乏是麓矮势裁露蔫，纛光栽蠢猿藏荧系。稳圈裁慧浓度稀壤豹C V F - B A C 5 奄C V F 鼯落多 C N E 2 绸藏椿的抑制效应脊显著统计学差异口 O 0 5 ) ，联合
13、甩药继续培莽4 8 小对嚣耜对抑潮攀( 6 8 3 3 圭3 0 9 ) 与单独赢用C V F - B A C 5 、B 1 I - B A C 5 的摇对撺制率( 4 3 3 6 4 5 5 0 、4 5 7 8 - 士4 2 0 ) 相比明照升高( P C V F 撬饕体灌瞧瓣定羹溺定l 锈；宙补体的新鲜豚鼠血清能设敏化的绵羊甑斑细胞溶搬，当血清与C V FC V F - B A C m 知鞋A 岛联台靶彝治疖彝程癌耱搏井实验磺巍孵育，C V F 能耗竭血清中的补体，从而能抑制新鲜血清的溶血作用。参照T a k a h a s h i 的方法测定，将C V F 用明胶巴比妥缓冲液( G V
14、 B 2 + ) 镎魄稀释，每个浓度分掰骰两个复镑。每管翔C V F 0 1 m l ，C V F 含量分聚麓6 4 u g ，1 2 B u g ，2 5 6 u g ，0 5 1 2 u g ，另取管加O 1 m I G V B 2 + 液，一臀加C V F 0 1 m l含3 2 0 u g ，除最后一镣加0 5 r n l G V B 2 + - 液，其余务如l ：1 0 0 新鲜豚鼠斑滂0 5 m l ( 瘸G V B 2 + 液稀释) ，3 7 * ( 2 瘩浴3 0 势锋，不眩藏荡，茄加两管，一麓加0 6 m l 舣蒸水，一臀加O 6 m l G V B 2 斗液各管加0 4 r
15、 n l5 1 0 S m l 敏化绵羊缀细胞( 敏化缡羊红缎胞的制各见抗祷体定性实骏) ，3 7 “ C 继续水港1 5 分辨，不时振荡，各管加入2 r n l 冷G V B 黔液终止反应，2 0 0 0 r p m 帮洛5 分锋，溅各管在5 4 1 r i m 的光密殿值( 0 D ) 。根据抗溶率Y 叫念溶管O I - 样本管O D ) ，套溶管O D ，戳Y 攫l 为Y 轴， l 崦C V F 剂量为x 轴，馆回归方瑕。当Y ( 1 Y l时，抻籁了5 0 溶盎鹩C V F 蠢l 量瓮义为一个抗辛 体单位。( 5 ) C V F 溶肌活性的测定I 删：用G V B 2 + 对比稀释残5
16、 个浓度缀，每个浓度缀设两个复警，每营O + l m l 。各浓度缀C V F 蠹孽含蠹分剐为1 6 0 、4 0 、l O 、2 。5 、0 6 2 5 u g ，茄一管魏e ，l m lG v B 2 + 备瞥分别加0 0 5 m l 新鲜豚鼠斑清和0 1 m l5 x l O S m l 豚鼠红细胞。3 7承浴4 0 分铮，不盼振荡，然屠加5 n f i G V B + 终熊反应，2 0 0 0r p m 离心5分钟，戳袋后一管律为参沈，测备筲在4 1 2 r i m 豹先密度( 0 D ) 僮。溶斑率为Y 群本管O D 4 等溶管O D ，以】0 9 Y ( 1 Y ) 】为y 辛由，以l o gC V F 剂量为x 轴， 作国归方嘏。班Y ，( 1 一驴l 时的C V F 裁量定义为一个溶血单位。二、C V F 和B A C s 的偶联及鉴定1
