《小儿支气管哮喘与血小板活化因子乙酰水解酶基因多态性的相关性研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《小儿支气管哮喘与血小板活化因子乙酰水解酶基因多态性的相关性研究（50页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、原 创 性 声 明本人声明:所呈交的硕士学位论文，是本人在指导教师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中己经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已 经发表或撰写过的作品成果。 对本文的研究做出重要贡献的个人和集体， 均已 在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学 位 论 文 作 者 签 “ “ A 了 日 期 : A 0 0 3 年 一月6 日关于论文使用授权的说明本人同意学校有权保留并向国家有关部门送交学位论文的复印件，允许论文被查阅和借阅。同意部分内容，( 或不同意) 学校及国家有关机构有权公布论文的全部或并采用影印、缩印或其他复制手段保存论文
2、。论文作者签名:I a 41 指 导 教 师 签 “ :落 、 讲 菜日期:。， 0 3 6 .日 期 :2 V - ; . . 吉 林 大 学 硕 士 学 位 论 文英 文 缩 写 词P AFP AF - AHL y s o - P A FP CRAS - P CRL TE OSMCI LC KH工A血小板活化因子血小板活化因子乙 酞水解酶溶血性血小板激活因子聚合酶链式反应等位基因 特异性聚合酶链式反应白三烯嗜酸性粒细胞肥大细胞白介素细胞因子人类白细胞抗原肿瘤坏死因子a气道高反应性最大呼气流速绷氛酸苯丙氛酸精氨酸组氨酸丙氛酸异亮氛酸苏氛酸a 卜吟PEFValPheArgHisAlalleTh
3、r吉 林 大 学 硕 士 学 位 论 文提要目 的 探讨血小板活化因子乙 酸水解酶 ( P A F - A H) 活性及其墓因多态性与儿童哮喘发病之间可能的关系 及其基因多态性同酶活性的关系。 方法 应用酶水解底物显色法测定血浆P A F - A H活性。应用等位基因 特异性聚合酶链式反应( A S - P C R服术， 检测P A F - A H基因第9 外显子G 9 9 4 - T 基因型. 结果 重度哮喘组P A F - A H活性明显低于轻、中 度哮喘组和对照组 ( P 0 . 0 5 ) .轻、中 度哮喘组与对照组三种基因型 ( G G . G T . T T ) 相比在分布上无显著
4、性差异 ( P均 0 . 0 5 ) ， 但重度哮喘组基因型与对照组及轻、中度哮喘组相比差异显著 ( P 均 0 .0 5 ) e结论 重度哮喘组血浆P A F - A H活性明显降 低， P A F - A H参与了 哮RA 的发病。 P A F - A H基因多态性 ( G 9 9 4 - T ) 与儿童哮喘病情轻重吉 林 大 学 硕 士 学 位 论 文有关而与发病无关， 重度哮喘组与T 等位基因突变 相关 联。 队F 一H基因( G 9 9 4 - T) 突变可以导致血浆P A F - A E活性缺失或下降， 它与酶的活性相关联.关键词支气管哮喘血小板活化因子乙 酞水解酶基因多态性儿童吉
5、 林 大 学 硕 士 学 位 论 文前言1 9 9 5年 WH O和 N I H联合推出的 全球性哮喘防治创议( G I N A ) ) 将支气管哮喘定义为:是由嗜酸性粒细胞 ( E O S ) 、肥大细胞( M C ) 和T 淋巴细胞等多种炎 症细 胞参与的气道慢性炎症。这种炎症使易感者对各种激发因子具有气道高 反应性 ( A H R) ，并引 起气道缩窄。支气管哮喘是儿童呼吸系统常见病、多发病。近年来， 其发病率和死亡率呈逐年增高 趋势。 全球约有1 .6 亿以上患者，我国至少有2 - 3 千万， 各国患病率为1 % - - 1 3 %不等， 我国患病率为1 % - 4 %， 因 此哮喘已
6、 成为 世界范围内的重要研究课题。 随着分子生物学和遗传学的发展， 哮喘已 被证实 是一种具有明显家 族聚集倾向的多 基因 遗传性疾病 I 。 在哮喘的 发病 机制中 气道慢性炎 症被认为是哮喘的本质， 哮喘的炎 症反应是由多种炎 症细胞、 炎性介质和细胞因子参与的结果。血小 板活 化因 子( P A F ) 是目 前公认的 一种最强的炎 症介质2 1它 属于 磷脂类物质， 是由 磷脂酸 A Z ( P L A 2 ) 作用于 膜磷脂而形成的， 具有多 种生物学 作用3 -0 1 .目 前已 证实 嗜酸 性粒细 胞、 嗜碱性粒细胞、中性粒细胞、 血小板、单核细胞、巨 噬细胞、肥大细胞、血管内
7、皮细胞及表皮细 胞受到刺激后均可 合成 P A F -6 1 , P A F作为一种炎症介质， 参与了 许多疾病的病理过程， 特别是过敏性疾病和吉 林 大 学 硕 士 学 位 论 文炎症性疾病， 目 前普遏认为P A F 参与了 哮喘。 P A F 除了 可诱发急性及迟发性支气管收缩外尚可使肺微血管收缩。 有效灌注量减少， 并可使粘膜分泌增强， 支气管管腔进一步狭窄; 还可使各种炎性细胞在肺内聚集并激活，导致炎症细胞趋化因子、组胺、5 - -A 色胺、白三烯C 4 ( L T C 4 ) . L T D 4 、 血栓素A 2 . 溶菌酶 、 氧自 由 基及P A F 本身等细 胞代谢产物和介质
8、释放， 这些物质一方面损伤肺组织及支气管粘膜上皮， 致使气道反应性增高， 另一方面又会使气道炎症进一步加剧，形成恶性循环， 从而导致哮喘的发生。目 前已 确定 P A F是一种与哮喘关系密切的炎 性介质， P A F - A H通过催化P A F 降解而参与炎症反应， 它在调控P A F 含量中 发挥重 要作用， 所以P A F - A H的活性在炎症性疾病中具有很重要的意义。 血浆P A F - A E不仅能降解P A F而 且能清除氧 化的 磷脂(7 1 ， 具有重 要的 生 理和病 理作用，P A F - A B活性降低必然会引 起某些病理过程，目 前有关P A F - A H诸多方面的
9、研究已 受到国内 外学者的关注。随着现代分子生物学和遗传学的不断发展， 对哮喘的 发病机制的 研究日 渐深入， 哮喘和遗传的关系 也日 益受到重 视。 目 前 发现4 q ,5 q , 6 q , 6 P , 7 q , 1 1 q , 1 2 q , 1 6 q 等染色 体区 域中 的 众多 基因 与 哮喘 有连 锁关系 ， 以5 g 3 1.3 3 关系 最为 密 切。 染色 体5 q上 有 众多 的 基因 可能 在I g E 合 成以 及过 敏和 哮 喘 相关炎 症的 发生 发 展中 起重 要作吉 林 大 学 硕 士 学 位 论 文用. 其中 最 重 要的 一 组 基因 位于5 砂-3
10、3 ， 又 称白 介 素4 ( I L - 4 ) 基因丛，编码数种促炎症细胞因子 ( C K) ，主要为 介: 型 C K ，包括I L - 3 . I L - 4 . I L - 5 . I L - 9 . I L - 1 3 。其他基因可调节口 : 肾上腺素受体( a 2 A R ) 、 淋巴细 胞糖皮质激素受体 ( G C R ) 和L T C 4 合成酶。同胞配 对研究 发 现 血中 嗜酸 性 粒细 胞 数量 与5 q 3 1-3 3 上9个 标志 物连锁。资料显示 I L - 9基因是一个重要候选基因，其多态性影响血清I g E 水平。 基因 组筛 选 及连 锁分析证实6 q 中
11、的某 些 标志 物与 过 敏性疾病家族成员的E O S计数有关，而具有这些标志物的等位基因位于6 8 2 1 .3 -2 3 . 多 种与 过 敏 反 应 表 型 相关 的 标 志 物 位于l 1 g 13 ， 有 证 据表明 过 敏性家 族 成员 中6 0 % 左 右其 症 状受 到1 呵 变 应 性 基因 所 影 响。目 前已 知在6 P染色 体上与哮喘有关的基因 有:人类白细胞杭原 ( H L A) 基因、肿瘤坏死因子a ( T N F - a) 基因和本文所研究的P A F - A H基因， 前两种与哮喘的关系国内 外研究的较多，P A F - A H基因 与哮喘的关系国 外 报道 较
12、少， 国内 尚 未 见 报道。 此外 在4 q . 7 q .1 2 q . 1 3 q . 1 4 q 等均 发 现与 调 控哮喘 有关的 基因 ， 由 此 可见 过 敏和哮喘的候选基因 位于多条染色 体的多个区 域， 显然有多 种基因参与了哮喘的发生。据S t a ff o r in i 报道 18 1 ， 血浆P A F - A H基因 定 位于6 P 12 -2 1 这个区域，它含有 1 2 个外显子及内含子，长约4 5 k b ，并报道在日 本人群吉 林 大 学 硕 士 学 位 论 文中 存在血浆P A F - A H基因 第9 外 显子V a l 2 7 9 - P h e ( G
13、 9 9 4 - T ) 突变， 这种突变导致第2 7 9 位置的撷氨酸残基被苯丙氨酸残基所取代， 由于这种突变导致了P A F - A H活性的丧失。另 有报道“ P A F - A H活性缺失频率在日本哮喘人群高于健康人群且哮喘的严重度与纯合子突变 相关联， 故认为P A F - A H基因是哮喘严重度的 调节部位。 有报道p o t 在第 9外显于上存在另一个突变 位点 G l n 2 8 1 - A r g亦可导致P A F - A H活性的 缺失. K r u s e 等p t 最近研究了白 种人群中P A F - A H基因 多态 性， 他们没 有证实 这两 种V a 1 2 7
14、9 - P h 。 和G l n 2 8 1 - A r g 多态性位点，但他们发现在白 种人群中 存在其他的突变位点，外 显子A r g 9 2 - H i s ( G 2 7 5 - A ) 、 第7 外显子I l e 1 9 8 - T h r ( T 5 9 3包括第- C ) 和第外显子A i a 3 7 9 - V a l( T 1 1 3 6 - C ) 的突变， 另外他们在第2 外显子上发现了 一新的多态性位点， 可能与 “ A T G ， 核芬酸序列位点相关的C -T突变.在他们的研究中发现T 5 9 3 - C和T I 1 3 6 - C突变与白种人哮喘均 存在 相关 性，
15、 其中T 5 9 3 - C与哮喘 人群中 血清I 醉水 平增高 存在相关性.为了 探讨P A F - A H基因多态性与我国 哮喘儿童的 相关性及其多态性与血浆P A F - A H酶活性的关系， 本文应用A S - P C R 技术检测了 哮喘患儿和正常儿重P A F - A H第9 外显子上G 9 9 4 - T基因 位点的突变情况， 同时应用酶水解底物显色法检测哮喘患儿和正常儿童血吉 林 大 学 硕 士 学 位 论 文浆P A F - A B活性以及不同基因型的酶活性， 为从基因水平筛选哮喘易 感人群，为 早期有效预防干预及今后的基因治疗莫定理论基础。吉 林 大 学 硕 士 学 位 论
16、 文材 料 与 方 法( 一 )主要试剂与仪器主要试剂小量基因组D N A快速纯化试剂盒 T a K a R a日 本P A F - A H活性 检测 试剂盒 G a g m a n 公司美国E D T A ( 已 二胺四乙 酸 ) 宝泰克中国异丙醇宝泰克中国无水乙 醇宝 泰克中国引物合成北京赛百盛生物工程有限公司中国血小板活化因子乙 酞水解酶 ( P A F - A H) 基因5 引 物序列引物P I : 5 - C T A T A A A T T T A T A T C A T G C T T 3 引物P 2 : 5 - T TT A C T A T T C T C T T G C T T T A C - 3 引物P 3 : 5 - T C A C T A A G A G T C T G A A T A A C - 3 引物P 4 : 5 - T C A C T A A G A G T C T G A A T A A A - 3 d N T P Mi x t u r e ( 2 . 5 m M e
