分子生物学课件第10讲

《分子生物学课件第10讲》由会员分享，可在线阅读，更多相关《分子生物学课件第10讲（56页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、Nanjing University第四章 以修复作用为中 心的DNA的安全 保障体系Nanjing University导致DNA不稳定的因素 1，偶然的复制错误 2，环境紫外线、电离 辐射化学物质（突变剂 ）造成的核酸分子损伤 3，外源遗传物质的侵 入Nanjing University保证DNA稳定性的机 制 1，复制修复系统 2，损伤修复系统 3，限制-修复系统Nanjing University第一节 复制修复一、尿嘧啶糖基酶系统 （一）DNA中尿嘧啶的产生 （二）尿嘧啶糖基酶系统 的组成 （三）修复过程Nanjing University二、错配修复系统（mismatch repa

2、ir system） （一）错配修复系统的组 成 （二）错配修复的过程Nanjing University1，错配矫正酶与未甲基 化的GATC及同一条链上的 错配碱基结合 2，错配矫正酶在两者之 间切除一段包括错配碱基 的DNA单链Nanjing University3，DNA聚 合酶III 进行缺口 充填 4，DNA连 接酶连接 切刻Nanjing University（三）错配修复系统其他 作用 1，去除渗入DNA的碱基类 似物 2，在基因转换中起重要 作用Nanjing University第二节 损伤修复致损伤因素 DNA分子损伤的类型 一、胸腺嘧啶二聚体的产生及 其后果 二、胸腺嘧啶

3、二聚体修复的生物学 指征 （一）细菌的活存曲线 （二）修复类型Nanjing University1，光复活（photoreactivation） 2，暗修复 除了可作用于胸腺嘧啶二聚 体外，还可以修复其他类型 的损伤，包括： （1）切除修复 （2）重组修复 （3）SOS修复 （4）二聚体糖基酶修复Nanjing University三、胸腺嘧啶二聚体修复的分子 生物学机制 (一）光复活（photoreactivation） 1，光复活的定义 2，光复活的过 （二）切除修复 1，切除修复一般过程 2，大肠杆菌的切除修复 （1）修复过程Nanjing University（2）大肠杆菌切除修 复

4、的类型 短补丁修复（short- patch repair） 长补丁修复（long-patch repair） 3，真核生物的切除修复Nanjing University（三）重组修复 1，除Uvr系统之外，还存在 其他的暗修复系统 2，重组修复（复制后修复） 的机制 （1）重组修复的姐妹链交换 假说（图4-10） （2）重组修复所涉及的基因Nanjing University（四）SOS修复1,SOS反应2,SOS修复的概念3,SOS修复的结果4,RecA蛋白在SOS修复中 的作用Nanjing University(1)RecA蛋白的主要生化活性 (2) RecA蛋白的作用 5,LexA蛋

5、白在在SOS修复中的 作用(1)LexA蛋白的作用是一种阻遏蛋白,结合于SOS 系统中各基因的操作子上, 使得这些基因不能产生转录 产物Nanjing University对自身基因的表达也有负向 控制作用,但正常细胞中其表 达量足以阻遏所有SOS基因的 表达 当细胞DNA复制受阻时，LexA 蛋白被RecA蛋白触发，发生 自身催化的水解作用，SOS系 统被激活，lexA基因表达也 增加Nanjing UniversityNanjing UniversityDNA复制正常后,RecA蛋白 失活,LexA蛋白恢复对SOS 系统的阻遏作用Nanjing University(2)由LexA控制的S

6、OS基因构成一个 调控元LexA控制17个基因,统称 din(damage inducible genes)基 因,或SOS基因SOS框：所有SOS基因的操作子都含 有20bp的LexA结合位点,称为SOS框 (SOS box) Nanjing University（五）嘧啶二聚体糖 基酶修复系统 与非标准碱基的修复 机制相同Nanjing University四、其他损伤类型及其修复（一）非标准碱基的修复1，非标准碱基及其相应的DNA糖基酶非标准碱基包括：尿嘧啶、次黄嘌呤、 3-甲基腺嘌呤等第一类DNA糖基酶无内在AP内切酶活性第二类DNA糖基酶有内在AP内切酶活性Nanjing Unive

7、rsity2， DNA糖基酶的修复机制与尿嘧啶糖基酶的修复机 制相同第一类去除非标准碱基后 ，还可以通过DNA碱基插入酶进行修复Nanjing University（二）碱基的丢失 1，去嘌呤作用（depurination ）：嘌呤碱基自发水解导致 2，无碱基内切酶的作用修复去嘌呤作用造成的损伤，也 负责修复DNA中的尿嘧啶和次黄 嘌呤 特异切断无碱基核糖的5-磷酸的 3-酯键Nanjing University3，碱基插入酶目前只发现一种嘌呤碱基插入酶专一性在AP位点插入互补的嘌呤碱基嘌呤碱基的供体可以是自由碱基或 嘌呤脱氧核苷。大肠杆菌的酶可以 利用dATP和dGTPNanjing Uni

8、versity（三）烷基化损伤的修复1，烷基化的主要位点嘌呤碱基的N-7、N-3位、O- 6位以及磷酸骨架2，Ada蛋白在烷基化损伤的修复中的作用Nanjing University（1）ada基因产物 Ada蛋白（O6-甲基鸟嘌呤甲基转 移酶，MGMT）有354个Aa， 39KDa （2）Ada蛋白的自杀行为 Ada蛋白可去除鸟嘌呤O6甲基，及 甲基磷酸三酯上的甲基。两种甲基 分别不可逆地结合于该酶的 Cys321和Cys69上。去除一个甲 基要消耗一个酶分子。Nanjing University3，E.coli对烷基化的适应性反应（1） Ada蛋白的作用携带了甲基的Ada蛋白成为自身 基因

9、和其他三个基因（alkA， alkB，aidB）的诱导物，结合于 基因RNA聚合酶结合位点的上游。其结合位点的一致序列为： AAANNAAAGCGCANanjing University（2）alkA基因的作用编码烷基化DNA糖基酶，该酶能去除 3-甲基腺嘌呤， 3-甲基鸟嘌呤，O2- 甲基胞嘧啶， O2-甲基胸腺嘧啶等烷基化碱基（3）alkB的作用基因产物负责细胞毒素损伤的DNA的切除修复Nanjing University（四）链的断裂1，造成DNA链断裂的因素2，修复方式（1）单链断裂修复有一部分是直接通过DNA连接酶 将切刻两端的5磷酸根与相邻的 3羟基连接加以修复Nanjing Un

10、iversity（2）双链断裂修复已知参与双链断裂修复的哺乳 动物基因有： DNA-PK，XR-1，XRFCCI基 因修复的简单过程是：断裂的末 端被切平，产生3-OH和5-P ，然后两个片段被连接起来。Nanjing University（五）交联1，致交联因素某些抗生素（如丝裂霉素）致癌剂和化疗药2，交联种类链内交联链间交联3，修复方式主要依靠切除修复Nanjing University（六）真核生物的修复系统1，酵母与辐射损伤修复有关的基因统称 为rad基因，分成三组：（1）与切除修复有关（2）与复制后修复有关（3）与重组修复有关Nanjing University各种修复都与转录过程有

11、关， 都倾向性地修复具转录活性的基 因，而且是首先修复模板链。可 能修复与RNA聚合酶有联系。 现已知rad3基因编码一种螺旋 酶（helicase），是与RNA聚 合酶结合的一种转录因子，是对 损伤区切割所必需的。Nanjing University2，哺乳动物 对损伤DNA的修复机制同原核 细胞的切除修复机制相似。已知 哺乳动物切除修复相关的基因与 酵母的rad基因存在同源性，表 明切除修复机制在各种生物中是 高度保守的 哺乳动物中已发现了重组修复机 制。这些修复系统都与遗传重组 过程有关Nanjing University3，真核生物蛋白质的多聚ADP核 糖基化与DNA修复的关系（1）真

12、核生物蛋白质的多聚ADP 核糖基化（ADP-ribosylation）在DNA断裂作用的刺激下，ADP 核糖基转移酶（ADPRT）迅速从 NAD+上将ADP核糖基转移到许多 核蛋白（包括ADPRT自身）上。Nanjing University（2）多聚ADP核糖基化 的可能作用观点一核糖基化的蛋白质通过 目前未知的途径促进 DNA的修复Nanjing University观点二ADP核糖基化使磷酸核糖焦 磷酸（PRPP）和ATP的储 备急剧下降，DNA损伤严重的情况下可能导致细胞死亡 。意义：防止畸变的DAN修复结果被复制而固定下来Nanjing University第三节 限制与修饰（ re

13、striction and modification）一、限制-修饰现象1，大肠杆菌噬菌体的限制和修 饰模式 表4-2Nanjing University2，大肠杆菌的限制-修饰系统 （1）限制-修饰作用：大肠杆菌的一种 酶系统可以识别外来的DNA，并以其限 制性内切酶活性将之切断（限制）； 另一方面，该系统可以识别细胞内DNA 中相同的限制性内切酶切割位点，并 对位点内的腺嘌呤或胞嘧啶进行甲基 化修饰（修饰），使之免遭限制性切 割，这两方面的作用即为限制-修饰作 用。大肠杆菌的这种酶系统就称为限 制-修饰系统。Nanjing University3，居民DNA同一细胞内具有同样的限 制-修饰

14、模式的不同类型 的DNA，包括细胞DNA，质 粒DNA，噬菌体DNA等Nanjing University二、限制-修饰系统的分 类（一）细菌中三种不同类 型的修饰-限制酶表4-3（二）II类修饰-限制酶Nanjing University1，酶分子的构成 限制酶和修饰酶是独立的两个酶2，识别位点 一般为4-6个bp的回文序列3，切割位点 大多数酶作用于底物DNA双链，位点在 识别序列中或靠近识别序列 少数酶能作用于回文序列相应DNA单链 序列Nanjing University4，对底物的作用全甲基化底物：不限制，不修饰半甲基化底物：不限制，修饰非甲基化底物：限制，不修饰Nanjing Un

15、iversity5，酶切位点 粘性末端和平齐末端：限制酶在DNA两 条链上的切口位置不同产生不同的末 端。粘性末端可以是5端的，也可以 是3端的。 同位酶：识别相同序列而切点不同的 限制酶 同尾酶：识别序列不同而切割产生的 粘性末端相同的限制酶Nanjing University（三）I类酶1，酶分子的构成（1）三个亚基：R、M、S亚基分别由hsdR、hsdM、和hsdS基因 编码；三个基因属同一个操纵元Nanjing University（2）两种功能 R、M亚基负责限制和修饰 S亚基负责识别DNA序列上特异靶位点（3）基因突变和万一保安机制 三个基因突变的表型 万一保安机制：M亚基参与R亚

16、基的功能，使M亚基突变时不致造成致死表型Nanjing University2，I类酶的作用位点（1）EcoB和EcoK的识别位点：一段3bp 的序列和一段4bp的序列中间夹着一段 任意序列 EcoB的识别序列：TGA（N）8TGCT EcoK的识别序列：AAC（N）6GTGCNanjing University（2） EcoB和EcoK的甲基化 位点 EcoB的甲基化位点：DNA双 链上N8任意序列两侧的两个 腺嘌呤 EcoK的甲基化位点：不详 （3） I类酶的切割位点 距识别位点1000bp以上Nanjing University3， I类酶的限制-修饰机制 图4-15 （1）M亚基首先与辅助因子S-腺苷甲硫 氨酸（SAM）结合，酶分子变构处于活 化状态 （2）酶-SAM与DNA结合后，在ATP的参与 下，对不同甲基化程度的底物产生不同 的限制-修饰作用 限制性切割位点的序列无特异性，但位 点的选择也并非是完全随机