《CITED2基因突变及甲基化与先天性心脏病关系的研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《CITED2基因突变及甲基化与先天性心脏病关系的研究（45页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、分类号：墅璺! ：!一U D C ：重庆医科大学密级：硕士学位论文论文题目C I T E D 2 基因突变及甲基化与先天性心脏病关系的研究作者姓名许敏指导教师姓名( 职称、单位名称)吴晓云主任医师重庆医科大学附属儿童医院申请学位级别硕士学科、专业名称儿科学( 心血管内科)论文答辩年月2 0 1 3 年5 月2 0 1 3 年5 月重庆医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得重庆医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，
2、与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。学位论文作者签名：寻敏日期：三D 乃牛2 2学位论文版权使用授权书本人完全了解重庆医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在欢读学位期间论文工作的知识产权单位属重庆医科大学。本人保证毕业高校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为重庆医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，并编入有关数据库迸行检索，可以采用影印、缩印或其他手段保存论文。保密论文在解密后适用
3、本授权书。论文作者签名：辞敬指导教师签名：氍芗日期：劢f ；午、2 ，乙目录符号说明l中文摘要。2英文摘要一4论文正文：C I T E D 2 基因突变及甲基化与先天性心脏病关系的研究。7前言7第一部分C I T E D 2 基因突变对转录因子H I F - I a 表达的影响9l 材料与方法。92 结果。1 43 讨论1 54 小结。1 7第二部分C I T E D 2 基因C p G 岛甲基化与先天性心脏病的关系。1 81 材料与方法1 82 结果。2 l3j = 寸论。2 24 小结。2 3全文图片2 4全文总结3 1参考文献3 2文献综述3 5致谢4 l攻读学位期间发表的学术论文目录4
4、 2重庆医科大学硕士研究生学位论文英文缩写H I F 1 旺T F A P 2V E G FC H DB S PM S PQ P C RP C Rb H L HT A Dp V H LV S DN T DA s nb pd e lCGSF英汉缩略语名词对照英文全称H y p o x i aI n d u c i b l eF a c t o r 一1a l p h aT r a n s c r i p t i o nF a c t o rA c t i v a t o r2V a s c u l a rE n d o t h e l i a lG r o w t hF a c t o rC o
5、 n g e n i t a lH e a r tD i s e a s eB i s u l f i t e - S e q u e n c eP C RM e t h y l a t i o n S p e c i f i cP C RR e a l - T i m eQ u a n t i t a t i v eP C RP o l y m e r a s eC h a i nR e m i o nB a s i cH e l i x L o o p ，- H e l i xT r a n s a c t i v a t i o nD o m a i nV o nH i p p e l
6、L i n d a ug e n ep r o d u c tV e n t r i c u l a rs e p t a ld e f e c tN e t l r a lT u b eD e f e c tA s p a r a g i n eB a s ep a i rD e l e t i o nC o d eG y lS e rP h e中文全称低氧诱导因子l 转录因子激活蛋白2血管内皮生长因子先天性心脏病亚硫酸氢盐结合测序P C R甲基化特异性P C R实时荧光定量P C R聚合酶链反应基本螺旋一环一螺旋结构转录区希佩尔一林道( V H L )病基因产物室间隔缺损神经管缺陷天冬酰胺
7、碱基缺失编码链甘氨酸丝氨酸苯丙氨酸重庆医科大学硕士研究生学位论文C I T E D 2 基因突变及甲基化与先天性心脏病关系的研究摘要目的：探讨先天性心脏病中C I T E D 2 基因突变的致病机制即对转录因子H I F 1 a 的表达的影响，同时检测先天性心脏病患儿C I T E D 2 基因启动子区C p G 岛的甲基化情况，并进一步研究C I T E D 2 基因的转录水平的改变，探讨其与先天性心脏病的发生的相关性。方法：将成功构建的C I T E D 2 ( c 5 7 3 5 7 8 d e l 6 ) 突变重组质粒及C I T E D 2野生型质粒分别转染到H e p G 2 及H
8、 9 C 2 细胞中，置于低氧培养条件下培养2 4 小时，分别提取R N A ，检测H I F l o t 的m R N A 的表达差异。同时4 8 小时后提取蛋白，检测H I F 1 0 t 蛋白的表达差异。收集3 1 例先天性心脏病患儿及2 例意外死亡儿童的右心耳组织，分别提取组织基因组D N A ，采用亚硫酸氢盐修饰试剂盒对基因组D N A 进行亚硫酸氢盐的修饰后并保存。利用生物信息学软件分析筛选其中两段，分别采用亚硫酸氢盐修饰结合测序法( B S P 法) 及甲基化特异性P C R 法( M S P法) 进行甲基化的检测。提取甲基化组及未甲基化组R N A ，并逆转录为c D N A
9、，运用实时荧光定量P C R 法检测两组C I T E D 2 基因m R N A 水平的表达差异。结果：1 H e p G 2 及H 9 C 2 细胞中均存在，H I F l a 的m R N A 的表达：野生重庆医科大学硕士研究生学位论文组与空载体组相比，表达量明显降低( P Al 例，c 5 7 4 A Gl 例，c 5 7 3 5 7 8 d e l 6 2 例) 存在于1 2 0 例C H D患儿D N A 中 1 l 】，为了进一步研究此突变的致病机制，C I T E D 2 ( c 5 7 3 5 7 8 d e l 6 )突变重组质粒及野生型质粒己成功构建【I2 1 。本研究将
10、在前期研究的基础上进一步研究C I T E D 2 ( c 5 7 3 5 7 8 d e l 6 ) 突变是否对转录因子H I F 1 a 的表达调控起一定作用。甲基化属于表观遗传学水平机制，主要是通过一C H ，的特定转移而影响基因转录的过程。D N A 的甲基化主要发生在C G 中。正常情况下基因组中半数以上的C G是甲基化的，而仅有一小部分的C G 是非甲基化的，主要集中在C p G 岛内。若C p G岛内发生甲基化则可促进疾病的发生，如阿尔兹海墨病、心力衰竭、动脉粥样硬化等均有研究表明与C p G 岛内异常甲基化的改变存在一定关裂1 3 44 1 。而对C H D的甲基化的研究近年来
11、也逐渐被重视。因C I T E D 2 的表达受精氨酸甲基转移酶的调控，结合C I T E D 2 基因序列分析发现，C I T E D 2 启动子区C p G 岛含量丰富，存在甲基化的结构基础，因此我们提出C H D 中可能存在C I T E D 2 基因的C p G 的甲基化，这也能够解释C H D 中仅有一小部分基因突变的发生的现象。为了验证这一观点，我们收集了C H D 患儿的心肌组织样本检测C I T E D 2 基因启动子区C p G 岛的甲基化情况，同时进一步检测了C I T E D 2 基因m R N A 的表达，明确C I T E D 2 甲基化是否与C H D 的发生存在一
12、定的关系。因此本研究将分两个部分展开：第一部分：C I T E D 2 基因突变对转录因子H F l a 的表达的影响。第二部分：C I T E D 2 基因C p G 岛甲基化与先天性心脏病的关系。重庆医科大学硕士研究生学位论文第一部分C I T E D 2 基因突变对转录因子H I F 一1 仅1 材料与方法1 1 主要仪器表达的影响I ) 细胞培养箱T h e r m o中国2 ) 倒置相差显微镜N i k o n日本3 ) 恒温水浴箱北京医药设备厂中国4 ) 荧光显微镜O l y m p u s日本5 1 低氧培养箱T h e r m o中国6 ) 荧光定量P C R 仪B i o R
13、 a d美国7 ) 蛋白电泳仪B i o R a d美国8 ) 蛋白质转膜系统B i o R a d美国9 ) 紫外分光光度计T h e r m o中国1 0 ) 冷冻离心机E p p e n d o r f美国1 2 主要试剂I ) D M E M 培养基儿研所中心供应室中国2 ) 胎牛血清G i b c o美国3 ) L i p o f e c t a m i n e T M 2 0 0 0l n v i t r o g e n美国4 ) O p t i - M E MG i b c o美国5 ) S s o F a s t T M E v a G r e e n S u p e r m
14、i xB I O R A D美国6 1H I F l0 【一抗Bi o w o r l d美国7 ) j - a c t i o n 抗B i o w o r l d美国8 ) 聚丙烯酰胺凝胶试剂盒碧云天中国9 ) 辣根标记山羊抗小鼠l g G碧云天中国1 0 ) 蛋白M a r k e rF e r m e n t a s加拿大9重庆医科大学硕士研究生学位论文11 ) S D S P A G E 蛋白上样缓冲碧云天中国液1 2 ) T r i z o II n v i t r o g e n美国1 3 ) 逆转录试剂盒T a K a l R a日本1 3 配制试剂( 1 ) 2 琼脂糖凝胶：取琼脂糖0 4 9 ，加入2 0 m l T A E ，混合均匀后置于锥形瓶中，放于微波炉里小火加热3 m i n ，取出倒入凝胶槽中，冷却l h 。( 2 ) 蛋白电泳缓冲液：S D S2 9 、T r i s6 0 4 9 、甘氨酸3 7 6 9 ，定容至2 L 。( 3 )
