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1、硕士学位论文M A S T E R SD I S S E R T A T l 0 N论文题目：实时荧光定量P C R 检测胃癌中D N A T 。T 。E甲基化 o l 即6 h 如A n a b d 蚺M 咖h 自nmG 蛐t o n 吖I I “t n m ep 0 1 y m 一( 】hR 口m天津医科大学硕士学位论文中文摘要目的：胃癌的发病是多种肿瘤基因，肿瘤抑制基因，D N A 修复基因，细胞周期调控因子及细胞黏附分子的遗传学和表遗传学改变的结果。D N A 甲基化作为一种表遗传事件在胃癌的发生发展过程中有重要的作用。研究肿瘤中D N A 异常甲基化对于探索肿瘤的发病机制有重要意义，
2、并且可能为肿瘤的检测提供新的分子检测方法。目前对D N A 甲基化进行检测的方法有很多，包括亚硫酸盐测序法，甲基化特异性P C R ( M S P ) ，M e t h y l i g h t 和C O B R A 等。多数方法集中于定性检测阶段，关于D N A 甲基化定量检测的报道较少。因此许多研究者致力于探索D N A 甲基化的定量检测方法。本实验研究目的是建立一种能广泛应用于临床的快速、简便、灵敏度和特异性较好、价格低廉的D N A 甲基化定量检测方法。应用本方法检测胃癌、癌前病变及正常组织中p 1 6 及h M L H l 基因D N A 甲基化的定量水平，为其临床应用建立实验基础。方
3、法：1 收集天津医科大学总医院2 0 0 7 年5 月至2 0 0 7 年7 月经胃镜下活检的组织标本，胃癌组4 2 例，癌前病变组( 不典型增生与肠化生) 4 6 例，对照组( 正常胃黏膜及慢性浅表性胃炎) 3 8 例。2 应用L i g h t c y c l e r 定量P C R 仪，以S Y B RG r e e nI 作为荧光定量检测标记，建立D N A 甲基化定量检测方法。3 定量检测胃癌、癌前病变及正常胃组织黏膜中p 1 6 及h M L H l 基因D N A 甲基化水平。结果：S Y B RG r e e nI 实时荧光定量P C R 检测方法灵敏度、重复性、特异性均较高，
4、最小检测极限为1 0 1 2 x 1 0 2c o p i e s u l 。6 次荧光定量P C R 反应标准品1 0 4 1 0 7 c o p i e s u l 浓度梯度的循环阈值( C t ) 均值分别为1 7 0 3 、2 0 2 6 、2 3 2 1 、2 6 6 3 ，各浓度梯度C t 值的批间变异系数( C V ) 分别是3 8 5 、3 3 5 、3 5 4 、2 3 5 。对亚硫酸盐处理后的甲基化及非甲基化基因溶解温度峰值T m 进行检测发现，溶解温度峰值在8 4 0 “ C - 8 8 0 “ C 左右，溶解温度单一，不含有模板的阴性对照及单纯双蒸水的空白对照组均未见特
5、异性峰值出现，研究还发现甲基化的特异性产物的溶解曲线峰值较非甲基化的溶解曲线峰值较高。天津医科大学硕士学位论文胃癌、癌前病变及正常组织病变中p 1 6 基因甲基化定量水平( 对数值) 分别是6 9 9 4 - 1 2 0 、5 4 0 + 1 4 8 、3 5 5 4 - 1 5 5 ，三组之间p 1 6 基因甲基化定量水平比较，差 异有统计学意义( 尸如0 5 ) ，任意两组之间比较差异有统计学意义( 尸锄) 。由正常组织、癌前病变到胃癌p 1 6 基因甲基化定量水平呈上升趋势。胃癌、癌前病变及正常组织病变中p 1 6 基因非甲基化定量水平( 对数值) 分别是3 7 8 4 - 1 7 7
6、、6 5 8 4 - 1 4 2 、7 - 3 1 4 - 1 0 8 ，三组之间p 1 6 基因非甲基化定量水平比较，差异有统计 学意义( 尸锄D D ，任意两组之间比较差异有统计学意义妒姐D 5 ) 。由正常组织、癌前病变到胃癌p 1 6 基因非甲基化定量水平呈下降趋势。不同性别、不同年龄阶段的胃癌中，p 1 6 基因甲基化定量水平差异没有统计学意义伊 D ) ；不同病理组织类型及不同病变部位的胃癌中p 1 6 基因甲基化定量水平差异没有统计学意义( 尸 n ) ；而不同恶性程度及是否伴有淋巴转移、血行转移的胃癌中，p 1 6基因甲基化定量水平差异有统计学意义伊 D ) ，不同病理组织类型
7、及是否伴有血行转移的胃癌中h M L H l 基因甲基化定量水平差异没有统计学意义( 尸 n D 5 ) ，而不同恶性程度及是否伴有淋巴转移的的胃癌中，h M L H l 基因甲基化定量水平差异有统计学意义( 尸 伊酊) B u tt h e r ew a ss t a t i s t i c a ls i g n i f i c a n c ei ng a s t r i cc a r c i n o m a sb e t w e e nt h eq u a n t i t a t i v el e v e lo ft h em e t h y l a t e dp 1 6g e n ea
8、n dt h e s ec l i n i c o p a t h o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c s ( 1 y m p h a t i cm e t a s t a s i s ，h e m a t o g e n o u sm e t a s t a s i sa n dt h el e v e lo fm a l i g n a n c y ) 妒 aD 5 ) B u tt h e r ew a ss t a t i s t i c a ls i g n i f i c a n c ei ng a s t r i cc a r c
9、 i n o m a sb e t w e e nt h eq u a n t i t a t i v el e v e lo ft h em e t h y l a t e dh M L H1g e n ea n dt h e s ec l i n i c o p a t h o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c s ( 1 0 c a t i o n ，l y m p h a t i cm e t a s t a s i sa n dt h el e v e lo fm a l i g n a n c y ) ( 尸 1 8 ) 。( 1 8
10、 ) 将提取的D N A 置于2 0 “ C 冰箱中保存备用。2 D N A 亚硫酸氢盐处理和纯化亚硫酸氢盐修饰D N A 步骤参考文斛15 1 ，具体步骤如下( 1 ) 取l u gD N A 溶至5 0 u l 的总体积中，加入5 5 u l3 MN a O H ( 新鲜配制) 使其终浓度为0 3 M ，混匀，短暂离心后，3 7 “ C 水浴1 0 分钟，使D N A 变性。( 2 ) 加入新鲜配制的1 0 m M 氢醌2 0 u l ，见其变黄后加J N 3 M 亚硫酸氢钠5 2 0 u 1 ( 用N a O H 调节p H 值至5 O ) ，混匀，简短离心后，上盖2 0 0 u l 矿
11、物油于5 0 。C 水浴1 6 d x 时。 ( 3 ) 于矿物油下小心吸取5 0 0 u l 液体，置于新的E p p e n d o 艚，加入l m l3 7 “ C 预热后冷却至3 0 的W i z a r dD N A 纯化树脂，颠倒混匀。( 4 ) 将5 m l 注射器针筒与微柱相连，将上述混合液转入到注射器中，插入针塞，缓慢而轻柔的将混合液推入微柱。( 5 ) 将注射器与微柱分离，拔出针塞，针筒与微柱重新相连，向针筒中加入8 0异丙醇2 m l ，插入针塞，缓慢将该液推过微柱。( 6 ) 移走注射器，将微柱放入新的E p p e n d o 皑；，1 2 ，0 0 0 r p m
12、离心2 分钟，干燥树脂。( 7 ) 再次将微柱放入新的E p p e n d o r 躇，加入预热6 8 。C 的去离子水5 0 u l ，静置1 分钟，1 2 ，0 0 0 r p m 离心1 分钟。( 8 ) 向上液 力I ：I X 3 MN a O H 5 5 u l ，室温变性1 0 分钟( 脱硫) 。天津医科大学硕士学位论文( 9 ) 力I A 3 M 醋酸钠5 5 u l ( 中和N a O H ) 和冷无水乙醇1 2 0 u l ，放置6 d , 时。( 1 0 ) 于4 。C - F 1 2 ，0 0 0 r p m 离，t 二, 1 5 分钟，小心弃去上清。( 1 1 ) 将
13、上述所得的沉淀用7 0 的乙醇洗涤，于4 “ C 下1 2 ，上清。( 1 2 ) 重复步骤( 1 1 )( 1 3 ) 室温挥发乙醇，加入5 0 u l T E 溶解。沉淀回收D N A 于2 0 0 0 0 r p m 离心5 分钟，弃( 1 4 ) 放入2 0 。C 冰箱中贮存备用。以此作为聚合酶链反应( P C R ) 扩增模板。3 标准品制备3 1 引物合成根据文献设计出针对亚硫酸氢盐修饰后的p 1 6 【1 5 I 和h M L H l t l 6 】基因甲基化和非甲基化引物序列，引物由赛百盛生物技术有限公司合成。具体引物序列如下：甲基化的p 1 6 ( p 1 6 一M )S e
14、 n s ep r i m e r 5 - 3 ：T T A 盯AG A GG G TG G GG C GG A TC G CA n t i s e n s ep r i m e r 5 - 3 ：G A CC C CG A AC C GC G AC C GT 从扩增目的条带大小为1 5 0 b p非甲基化的p 1 6 ( p 1 6 一U M )S e n s ep r i m e 5 - 3 ：佻订AG A GG O TG G GG T GG A TT G TA n t i s e n s ep r i m e r 5 一3 ：C A AC C CC A AA C CA C AA C CA
15、 T AA扩增目的条带大小为1 5 l b p甲基化的h M L H I ( h M L H l M )S e n s ep r i m e 5 - 3 ：A C GT A GA C GT T TT A TT A G G G TC G CA n t i s e n s ep r i m e r 5 一3 ：C C TC A TC G TA A CT A CC C GC G扩增目的条带大小为1 1 5 b p非甲基化的h M L H I ( b _ M L H l U M lS e n s ep r i m e 5 一3 ：T T TT G AT G TA G AT G TT T T A T T
16、A G GG T TG TA n t i s e n s ep r i m e r 5 一3 ：A C CA C C T C AT C A T A AC T AC C CA C A扩增目的条带大小为1 2 4 b p3 2P C R 反应体系10 x P C Rb u f f e r ( 不含M F + )2 5 u l M F +2 5 m6天津医科大学硕士学位论文四种d N T P 混合物上下游引物模板D N AT a q 酶二甲基亚砜( D M S O )三蒸水1 0 u l0 5 I t l + 0 5 u l2 0 u l0 2 5 I t l1 2 5 u 11 4 5 9 l3 3 反应条件p 1 6 一M 及p 1 6 - U M预变性循环( 3 5 个循环)变性退火延伸延伸h M L H l M 及h M L H l U M预变性循环( 3 5 个循环
